초록 ▼

전통 효모인 사카로마이에스 세레비제와 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리몰파에서 각각 재조합 알부민의 발현을 극대화할 수 있는 발현 시스템을 개발하는 한편, 시험 공정 규모의 발효 및 분리, 정제 기술 개발하였다. S. cerevisiae에서 갈락토즈를 대사하지 않고 유도물질로만 사용하게끔 galactokinase를 코팅하는 유전자를 결손시킨 $\vartriangle$gal1 변이주를 제조하였다. $\vartriangle$gal1변이주 성장에 필요한 탄소원으로 글루코즈를 공급해 줄 수 있도록 gl

전통 효모인 사카로마이에스 세레비제와 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리몰파에서 각각 재조합 알부민의 발현을 극대화할 수 있는 발현 시스템을 개발하는 한편, 시험 공정 규모의 발효 및 분리, 정제 기술 개발하였다. S. cerevisiae에서 갈락토즈를 대사하지 않고 유도물질로만 사용하게끔 galactokinase를 코팅하는 유전자를 결손시킨 $\vartriangle$gal1 변이주를 제조하였다. $\vartriangle$gal1변이주 성장에 필요한 탄소원으로 글루코즈를 공급해 줄 수 있도록 glucose repression에 관여하는 MIG1 또는 HXK2가 파쇄된 변이즈를 제작하였다. H. polymorpha MOX 유전자가 파쇄되어 메탄올 분해 능력이 극소화된 $\vartriangle$mox 변이주를 만들어 범용 숙주로 개발하였다. $\vartriangle$mox 변이주는 낮은 농도의 메탄올을 함유한 베지에더도 메탄올에 의해 발현 유도되는 재조합 단백질을 고효율러 생산할 수 있다. 그리고 구성적 발현을 위항 GAPDH 프로모터를 이용한 발현벡터를 제작하여 알부민을 고효율로 발현하면서 pH 유지에 의해 균체 자가분해가 일어나지 않는 배양조건을 확립하였다. 한세눌라 폴리몰파 gcr 변이주는 포도당 배지에서 MOX 프로모더에 의한 재조합 알부민 생산에 매우 유용할 것이다. H. polymorpha 로부터 생산된 재조합 알부민의 분이, 정제 공정을 확립하고, 정제된 재조합 알부민의 특성을 분석하였다. 정제된 재조합 인체 알부민의 아미노산 조성은 이론치와 일치하였으며, 인체 혈정 알부민과 동일한 생화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 재조합 알부민 발현을 위하여 개발된 효모 발현 시스템은 다양한 치료용 단백질의 발현에 응용될 수 있는 범용성을 지니고 있어 재조합 단백질 생산을 위한 기반 기술로도 활용될 수 있다.

Abstract ▼

The demand for human serum albumom (HSA), and important serum potein has been increased with various needs in clinical. However, its supply has been limited by the shortage of source material and the potential rick of contamination of pathogenic virus such as HIV and hepatitis. The development of re

The demand for human serum albumom (HSA), and important serum potein has been increased with various needs in clinical. However, its supply has been limited by the shortage of source material and the potential rick of contamination of pathogenic virus such as HIV and hepatitis. The development of recombinant human serum albumin (rHSA) is to be an alternative method to overcome drawbacks assocoated with blood plasma-derived matertials. Because HSA has a low unit price compared to other protein therapeutics, the process must be optimized to maximize production yield. In this study, we have constructed rHSA expression systems in the traditional yeast, Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast, Hansenulla polymorpha. Fermentation and purification proceeses for rHSA production habe been also investigated to supply more sample and efficient method in industrial production.
Whem GAL promoter is utilized in the production of recombinant protein, galatose is comcumed by yeast as carbon source for cell growth as well as inducer. To improve this problem, the gall dedltion mutant($\vartriangle$gal1) strain was constructed by disruption of GAL1 gene coding for galatokinase. Even with extremely low concentration of galatose, the $\vartriangle$gal1 strain produced an amount of rHSA comprarable with the wild type. Futhermore, rHSA expression in $\vartriangle$gal1 strain was saturated by means of the multicopy integration of the expression cassette into $\delta$-region and one copy integration into URA3 regionon the yeast chromosome. The mutant strain, which has the stable expression cassettes about 8~10 copies, could be applicable as a production strain in industrial scale. The $\vartriangle$gal1 strain needs an alternative carbon source instead of galatose for cell growth. In order to privide glucose as carbon source, MIG1 and/or HXX2 genes assuming that they are play an important role in glucose repression, were deleted in the $\vartriangle$gal1 strain. As a result of above mutation, in the $\vartriangle$gal1 $\vartriangle$hxk2 strain the glucose repression was reduced and the production of rHSA was increased. Furthermore, the $\vartriangle$gal1 $\vartriangle$hxk2 strain showed that it could be cultured with high cell density by continous feeding of glucose.
Methylotrpic yeasts such as Pchia pastoris and Hansenulla polymorpha, are of interest since they have been found to be a useful organism for efficiently expressing heterologous proteins. MOX gene in H.polymorpha was deleted in order that rHSA is expressed at the low concentration of methanol. When rHSA is espressed under the control of MOX promoter, the $\vartriangle$mox strain will come in useful because it does not consume excessibe amount of methanol. The plasmid pMLT-delta, which can itergrate into MOX region in chromosome, was constructed. Thd $\vartriangle$mox strain, in which it is possible to intergrate and pop-out of a certain gene in transformat using pMLT-delta, can be usdful as a host strain for expression of various recombinant proteins. We have also attempted a constitutive expression of rHSA in H. polymorpha by GAPDH promoter which can induced without a inducing factor. In the case of the expression ventor was intergrated into GAP gene locus, the production of rHSA and the stability of expression cassette was higher than that it was integrated into other regines. The rHSA production was highesr in the medium containing glycerol as a carbon source. Autolysis of yeast and proteolytic degradation of rHSA in the prolonged culture were protected by the maintemance of pH with 0.1M calcium phosphate.

목차 Contents

• 제1장 연구개발과제의 개요...14
• 제2장 국내외 기술개발 현황...16
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...18
• 제1절 GAL1 유전자가 결손된 효모 S.cerevisiae 에서의 재조합 인체 알부민 분비생산...18
• 제2절 Glucose억제가 완화된 S.cerevisiae변이주 개발 및 이를 이용한 재조합 인체 알부민 발효공정 개발...45
• 제3절 MOX 유전자가 파쇄된 효모 한세눌라 폴리모파 신규 변이주개발 및 이를 이용한 재조합 알부민 생산 시스템 구출...65
• 제4절 한세눌라 폴리모파에서의 GAPDH 프로모터를 이용한 재조합 알부민의 생산...82
• 제5절 Glucose억제가 완화된 H. polymorpha변이주 개발 및 이를 이용한 재조합 인체 알부민 생산...112
• 제6절 H.polymorpha로부터 MOX 프로모터를 이용한 재조합 인체 알부민 생산을 위한 전산제어 발효공정 개발...131
• 제7절 재조합 인체 알부민의 분리정제 및 특성연구...147
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...157
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...159
• 제6장 참고문헌...160
• 위탁과제 재조합 효모를 이용한 알부민 발효공정 최적화...169