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문제 정의
- polymorpha도 HSA를 효율적으로 분비 발현할 수 있음이 보고되었다[9, 10, 16, 18]. 따라서 본 연구에서는 전장 혹은 HSA 단편을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효율적으로 분비할 수 있는 H. polymorpha용 분비발현 시스템을 개발하고자 하였다.
- 메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다.
제안 방법
- 100 μl씩 4개로 나누어 분주하고 각 tube에 각각의 pYHSAft (1-4) 또는 pYHSAft-GFPuv (1-4) 플라스미드 1 μg, salmon sperm DNA (Sigma-Aldrich, 10 mg/ml) 10 μl, PEG/LiAc 완충용액 (50% polyethylene glycol 4000, 0.01M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1M LiAc, pH 7.5) 600 μl를 혼합하였다.
- 마지막으로, pUC18- HSAft 벡터를 4세트의 프라이머 쌍(TAG-d3/HSA-u1), (TAG-d3/HSA-u2), (TAG-d3/HSA-u3), (TAG-d3/HSA-u4)을 사용하여 PCR 하였다. 4종류의 각각 크기가 다른 PCR 산물을 회수하여 제한효소 HpaI으로 처리한 후 self-ligation 하여 4종류의 pUC18-HSAft (1-4) 벡터를 구축하였다.
- 이때 HSA 단편의 크기는 기존에 보고된 HSA의 삼차 구조를 바탕으로 결정하였으며 HSA 융합단편 1은 N-말단에서부터 137개, 융합단편 2는 172개, 융합단편 3은 320개, 융합단편 4는 608개(전장) 아미노산이 포함되도록 디자인 하였다[25, 28]. 4종류의 융합 단편 HSAft (1-4) 각각을 H. polymorpha용 발현 벡터 pYHSA13 (T-1)m에 클로닝하여 4 종류의 H. polymorpha용 HSA 융합단편 발현 벡터 pYHSAft (1-4) 세트를 구축하였다(Fig. 1).
- Each vector was designed to express four different sizes of HSA fusion tags, 137, 172, 320, 608 aa residues from its N-terminus, respectively. In addition, functional domains including His8-tag, 2 ×(Gly4Ser1 linker), Tobacco etch virus protease cleavage site, multiple cloning sites, and Strep-tag were followed each HSA fusion tag.
- Genomic DNA를 추출하기 위해 16시간 동안 YPD 액체 배지에서 진탕 배양한 효모 배양액을 4,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 침전된 균체를 STES 완충용액 [0.5 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), pH 7.6]으로 세척하고 다시 STES 완충용액 30 μl로 균체를 현탁하였다.
- YPM 액체 배지에서 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후 슬라이드 글라스(Slide glass)에 배양액 10 μl를 떨어뜨려 커버 글라스(Cover glass)로 덮어 고정 시킨 후, 공초점현미경(LSM510meta, Zeiss, Germany)으로 발광파장(excitation wavelength): 395 nm, 방출파장(emission wavelength): 509 nm으로 1,000배 확대하여 관찰하였다.
- pGFP-uv (Clontech, USA)를 프라이머 쌍(GFPuv-F/GFPuv-R)으로 PCR하여 확보한 약 700 bp GFPuv 단편을 제한효소 NheI과 EcoRV로 처리하고 같은 제한효소로 처리한 pYHSAft (1-4) 벡터에 각각 클로닝하여 4종류의 pYHSAft-GFPuv (1-4) 벡터를 구축하였다.
- 본 연구에서 사용한 primer는 Table 2에 나타냈다. pYHSA13 (T-1) 벡터를 제한효소 EcoRI과 SphI로 처리하여 HSA 유전자 포함 1.8 kb 단편을 회수하고 이를 제한효소 EcoRI과 SphI로 처리된 pUC18 벡터에 클로닝하여 pUC18-HSA 벡터를 구축 하였다. 이어서, 제한효소 SphI로 처리된 pUC18-HSA 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d1/TAG-u1)으로 PCR 하였다.
- pYHSA13(T-1) 벡터 상에 존재하는 두 개의 EcoRI 제한효소 인지서열 중 하나는 유지하고 나머지 하나는 제거하기 위하여 부분절단과 Klenow 처리 후 self-ligation하여 pYHSA13(T-1)m 벡터를 구축하였다. 구축된 pYHSA13(T-1)m 벡터를 제한효소 EcoRI과 EcoRV로 처리하여 1.
- 각 HSA 융합단편을 이용한 세포내 단백질 발현 정도를 시각적으로 비교하기 위하여 4종류의 pYHSAft-GFPuv (1-4) 벡터 세트를 H. polymorpha DL1-L (leu2) 균주에 형질전환 하였다. 확보한 형질전환체 DHft1G, DHft2G, DHft3G, DHft4G를 YPM 액체 배지에서 배양하며 배지로 분비 발현된 HSAft-GFPuv 단백질을 공초점현미경을 이용하여 확인하였다.
- 공초점현미경으로 관찰한 결과를 바탕으로 상대적으로 타겟 단백질의 발현이 증가한 48시간동안 배양한 형질전환체 배양액을 취하여 세포 배양액과 세포를 회수하여 파쇄한 세포 파쇄액에서의 HSAft-GFPuv 융합 단백질의 발현여부 및 정도를 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과 세포 배양액으로의 단백질 분비는 pYHSAft1-GFPuv 벡터로 형질전환된 재조합 균주에 의한 HSAft1-GFPuv 융합 단백질 분비 발현양이 가장 많았고 나머지 융합단편 발현체들은 서로 비슷한 양으로 분비 발현되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- pYHSA13(T-1) 벡터 상에 존재하는 두 개의 EcoRI 제한효소 인지서열 중 하나는 유지하고 나머지 하나는 제거하기 위하여 부분절단과 Klenow 처리 후 self-ligation하여 pYHSA13(T-1)m 벡터를 구축하였다. 구축된 pYHSA13(T-1)m 벡터를 제한효소 EcoRI과 EcoRV로 처리하여 1.8 kb 단편을 제거한 후, 4종류의 pUC18-HSAft (1-4) 벡터를 제한효소 EcoRI과 SmaI으로 처리하여 확보한 4종류의 HSA fusion tag (1-4)을 각각 클로닝하여 4종류의 pYHSAft (1-4) 벡터를 구축 하였다.
- 5 kb의 PCR 산물을 회수하여 제한효소 HpaI으로 처리한 후 self-ligation 하여 pUC18-HSAgs 벡터를 구축하였다. 구축한 pUC18-HSAgs 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d2/TAG-u2)으로 PCR 하였다. 약 4.
- 다양한 크기의 HSA 단편을 융합단편으로 발현할 수 있는 벡터 세트를 확보하기 위하여 우선 이미 실험실에 확보한 HSA 발현벡터 pYHSA13(T-1) 로부터 5'-UTR-HSA-His8 단편을 E. coli용 high-copy 벡터인 pUC18 벡터에 서브클로닝 하여 pUC18-HSA 벡터를 제작하였다.
- 다시 5% 탈지분유에 1:5,000 또는 1:3,000으로 희석한 2차 항체 [IgG mouse-HRP (Sigma-Aldrich)]와 1시간 동안 교반 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 세척하였다. 단백질 시그널의 검출은 ECL AdvanceTM Western Blotting Detection Kit (AmershamTM-GE Healthcare, UK)의 용액으로 PVDF 막에 1분간 반응시켜 발색반응을 일으키고 암실에서 X-ray 필름에 노출시켜 확인하였다.
- 단백질 시료를 8% SDS-polyacrylamide 젤에서 전기영동한 후 젤에 전개된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막(Bio-Rad)으로 옮기기 위해 transfer caster에 조립하여 transfer buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris, 20% methanol)를 채운 상태에서 80 V로 1시간 동안 수행하여 전기적으로 부착시켰다. 단백질이 이동 부착된 PVDF 막을 5% 탈지분유[5% skim milk, TBS-T (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)]에 넣고 교반기에서 1시간 동안 반응시키며 비특이성 항체부착을 차단했다. 비특이성 항체부착을 차단한 막을 5% 탈지분유에 1:2,000으로 희석한 1차 항체[Strep-tag mouse monoclonal antibody (Sigma-Aldrich) 또는 GFP mouse monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA)]와 상온에서 1시간 30 분 동안 교반 후 TBS-T 완충용액으로 10분씩 3회 세척하였다.
- 또한 세포 파쇄액 시료를 준비하기 위하여 상층액을 옮기고 난 침전물을 -70℃에서 동결하여 얼린 후, 동일 부피의 0.4 mm acid washed glass bead와 세포용해(Cell lysis) 완충용액 (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM PMSF, pH 7.5)을 첨가하여 bead beater (Precellys 24, Bertin Technologies, France)로 2회에 걸쳐 세포를 파쇄하였다(1회: 6,000 rpm, 45초 작동, 5초 정지 × 3).
- 5 kb의 PCR 산물을 회수하여 제한효소 NheI으로 처리한 후 self-ligation 하여 pUC18-HSAft 벡터를 구축하였다. 마지막으로, pUC18- HSAft 벡터를 4세트의 프라이머 쌍(TAG-d3/HSA-u1), (TAG-d3/HSA-u2), (TAG-d3/HSA-u3), (TAG-d3/HSA-u4)을 사용하여 PCR 하였다. 4종류의 각각 크기가 다른 PCR 산물을 회수하여 제한효소 HpaI으로 처리한 후 self-ligation 하여 4종류의 pUC18-HSAft (1-4) 벡터를 구축하였다.
- 05% Tween20)]에 넣고 교반기에서 1시간 동안 반응시키며 비특이성 항체부착을 차단했다. 비특이성 항체부착을 차단한 막을 5% 탈지분유에 1:2,000으로 희석한 1차 항체[Strep-tag mouse monoclonal antibody (Sigma-Aldrich) 또는 GFP mouse monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA)]와 상온에서 1시간 30 분 동안 교반 후 TBS-T 완충용액으로 10분씩 3회 세척하였다. 다시 5% 탈지분유에 1:5,000 또는 1:3,000으로 희석한 2차 항체 [IgG mouse-HRP (Sigma-Aldrich)]와 1시간 동안 교반 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 세척하였다.
- 세포 배양액 내 단백질 시료를 준비하기 위하여 OD600 값이 20 또는 14에 해당하는 세포 배양액을 원심분리 하여 상층액을 확보하고, TCA (trichloroacetic acid, Sigma-Aldrich, USA)를 상층액의 1/10의 양을 첨가하여 섞어준 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 침전물에 100% acetone 700 μl를 첨가하여 4번 세척하였다.
- 아울러 각기 다른 크기의 HSA 융합단편을 이용한 외래유전자 분비발현 효율을 비교하기 위하여 상기 pYHSAft (1-4) 벡터에 단백질 발현 여부를 시각적으로 용이하게 확인할 수 있는 GFPuv 유전자를 도입하여 4종류의 pYHSAft-GFPuv(1-4) 벡터를 구축하였다.
- 즉 HSA의 N-말단으로부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H.
- 이어서, 제한효소 SphI로 처리된 pUC18-HSA 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d1/TAG-u1)으로 PCR 하였다. 약 4.5 kb의 PCR 산물을 회수하여 제한효소 HpaI으로 처리한 후 self-ligation 하여 pUC18-HSAgs 벡터를 구축하였다. 구축한 pUC18-HSAgs 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d2/TAG-u2)으로 PCR 하였다.
- 구축한 pUC18-HSAgs 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d2/TAG-u2)으로 PCR 하였다. 약 4.5 kb의 PCR 산물을 회수하여 제한효소 NheI으로 처리한 후 self-ligation 하여 pUC18-HSAft 벡터를 구축하였다. 마지막으로, pUC18- HSAft 벡터를 4세트의 프라이머 쌍(TAG-d3/HSA-u1), (TAG-d3/HSA-u2), (TAG-d3/HSA-u3), (TAG-d3/HSA-u4)을 사용하여 PCR 하였다.
- 융합단편으로 사용하는 각기 다른 크기의 HSA 단편이 분비 발현되는 정도를 비교하기 위하여 4종류 pYHSAft (1-4) 벡터 세트를 H. polymorpha DL1-L (leu2) 균주에 형질전환 하였다. 확보한 형질전환체 DHft1, DHft2, DHft3, DHft4를 YPM 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 후 배지로 분비 발현된 HSAft 단백질을 western blotting을 통해 확인하였다.
- coli용 high-copy 벡터인 pUC18 벡터에 서브클로닝 하여 pUC18-HSA 벡터를 제작하였다. 이 벡터를 주형으로 다양한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 selfligation을 반복하는 방법을 사용하여 단편으로 발현되는 HSA 혹은 이와 연결된 외래 단백질의 발현을 효율적으로 검출하고 정제할 수 있는 다양한 작용기 도메인을 도입하였다(Fig. 1). 즉 HSA 단편-His8와 여기에 연결된 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다(Fig.
- 메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다.
- 이렇게 확보한 HSA 전장 유전자와 각종 작용기 도메인을 갖는 pUC18-HSAft 벡터를 주형으로 4종류의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 self-ligation 함으로써 각기 다른 크기의 HSA 단편을 융합단편으로 사용하는 pUC18-HSAft (1-4) 벡터를 확보하였다. 이때 HSA 단편의 크기는 기존에 보고된 HSA의 삼차 구조를 바탕으로 결정하였으며 HSA 융합단편 1은 N-말단에서부터 137개, 융합단편 2는 172개, 융합단편 3은 320개, 융합단편 4는 608개(전장) 아미노산이 포함되도록 디자인 하였다[25, 28].
- 8 kb 단편을 회수하고 이를 제한효소 EcoRI과 SphI로 처리된 pUC18 벡터에 클로닝하여 pUC18-HSA 벡터를 구축 하였다. 이어서, 제한효소 SphI로 처리된 pUC18-HSA 벡터를 프라이머 쌍(TAG-d1/TAG-u1)으로 PCR 하였다. 약 4.
- 일반적인 plasmid DNA 분리 및 형질전환 실험을 위해 E. coli DH5α를 사용하였고, 배양조건은 타겟 재조합 균주 선별을 위해 Ampicillin (100 μg/ml)이 첨가된 LB 액체 배지(0.5% yeast extract, 1% bacto tryptone, 1% NaCl)를 사용하여 37℃에서 진탕 배양하였다.
- 1). 즉 HSA 단편-His8와 여기에 연결된 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다(Fig. 1).
- 침전물을 70% ethanol로 세척하고 말린 후 RNaseA가 첨가된 증류수(25 μg/ml)를 50 μl 첨가하여 37℃에서 30 분간 녹여서 genomic DNA를 얻었다.
- 준비한 세포 배양액 시료와 세포 파쇄액 시료의 단백질의 양을 측정하기 위하여 Bradford 분석법을 수행하였다[2]. 표준 단백질로 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 protein assay dye reagent concentrate (BIO-RAD, USA) 시약으로 표준검량곡선을 작성하고 각각 시료를 동일한 조건으로 분석하여 표준검량곡선을 통해 단백질 농도를 측정하였다.
- polymorpha DL1-L (leu2) 균주에 형질전환 하였다. 확보한 형질전환체 DHft1, DHft2, DHft3, DHft4를 YPM 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 후 배지로 분비 발현된 HSAft 단백질을 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, HSA 융합단편 1과 융합단편 2의 발현은 확인 할 수 없었으나 HSA 융합단편 3 그리고 전체크기 HSA 융합단편 4의 발현을 확인할 수 있었다(Fig.
- polymorpha DL1-L (leu2) 균주에 형질전환 하였다. 확보한 형질전환체 DHft1G, DHft2G, DHft3G, DHft4G를 YPM 액체 배지에서 배양하며 배지로 분비 발현된 HSAft-GFPuv 단백질을 공초점현미경을 이용하여 확인하였다. 배양한 세포를 공초점현미경으로 관찰한 결과 24시간 배양액에서는 4종류의 형질전환체 모두 녹색형광을 나타내는 것을 확인하였으나 전체적으로 그 세기가 약하였다(Fig.
대상 데이터
- Plasmid 추출에는 Plasmid mini prep Kit (Bioneer, Korea) 제품을 사용하였고, 모든 제한 효소는 TaKaRa (Japan) 제품을 사용하였다. 또한, T4 DNA ligase는 ELPIS (Korea) 제품, DNA polymerase는 Solgent (Korea), Bioneer, TaKaRa, iNtRon (Korea) 제품, 완충 용액에 사용된 시약, 항체, 항생제 및 기타 모든 시약은 Sigma-Aldrich (USA) 제품을 사용하였다.
- Plasmid 추출에는 Plasmid mini prep Kit (Bioneer, Korea) 제품을 사용하였고, 모든 제한 효소는 TaKaRa (Japan) 제품을 사용하였다. 또한, T4 DNA ligase는 ELPIS (Korea) 제품, DNA polymerase는 Solgent (Korea), Bioneer, TaKaRa, iNtRon (Korea) 제품, 완충 용액에 사용된 시약, 항체, 항생제 및 기타 모든 시약은 Sigma-Aldrich (USA) 제품을 사용하였다. 반응은 제조 회사의 권장 방법에 따라 수행하였다.
- 5% yeast extract, 1% bacto tryptone, 1% NaCl)를 사용하여 37℃에서 진탕 배양하였다. 본 연구에서 사용한 효모는 H. polymorpha DL1-L (leu2) 유래 균주[17]를 사용하였고, 효모의 일반적인 배양을 위하여 복합 배지로 YPD 액체 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)와 YPD 평판 배지(YPD, 2% agar) 그리고 YPM 액체 배지(1% yeast extract, 2% bacto peptone, 2% methanol)를 사용하였다. 형질전환 된 효모의 선별을 위하여 leucine이 결핍된 선택 배지인 SC-Leu 평판 배지(0.
- 이렇게 확보한 HSA 전장 유전자와 각종 작용기 도메인을 갖는 pUC18-HSAft 벡터를 주형으로 4종류의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 self-ligation 함으로써 각기 다른 크기의 HSA 단편을 융합단편으로 사용하는 pUC18-HSAft (1-4) 벡터를 확보하였다. 이때 HSA 단편의 크기는 기존에 보고된 HSA의 삼차 구조를 바탕으로 결정하였으며 HSA 융합단편 1은 N-말단에서부터 137개, 융합단편 2는 172개, 융합단편 3은 320개, 융합단편 4는 608개(전장) 아미노산이 포함되도록 디자인 하였다[25, 28]. 4종류의 융합 단편 HSAft (1-4) 각각을 H.
- 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다.
- polymorpha DL1-L (leu2) 유래 균주[17]를 사용하였고, 효모의 일반적인 배양을 위하여 복합 배지로 YPD 액체 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)와 YPD 평판 배지(YPD, 2% agar) 그리고 YPM 액체 배지(1% yeast extract, 2% bacto peptone, 2% methanol)를 사용하였다. 형질전환 된 효모의 선별을 위하여 leucine이 결핍된 선택 배지인 SC-Leu 평판 배지(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar)를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
이론/모형
- 또한, T4 DNA ligase는 ELPIS (Korea) 제품, DNA polymerase는 Solgent (Korea), Bioneer, TaKaRa, iNtRon (Korea) 제품, 완충 용액에 사용된 시약, 항체, 항생제 및 기타 모든 시약은 Sigma-Aldrich (USA) 제품을 사용하였다. 반응은 제조 회사의 권장 방법에 따라 수행하였다.
- 준비한 세포 배양액 시료와 세포 파쇄액 시료의 단백질의 양을 측정하기 위하여 Bradford 분석법을 수행하였다[2]. 표준 단백질로 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 protein assay dye reagent concentrate (BIO-RAD, USA) 시약으로 표준검량곡선을 작성하고 각각 시료를 동일한 조건으로 분석하여 표준검량곡선을 통해 단백질 농도를 측정하였다.
성능/효과
- 공초점현미경으로 관찰한 결과를 바탕으로 상대적으로 타겟 단백질의 발현이 증가한 48시간동안 배양한 형질전환체 배양액을 취하여 세포 배양액과 세포를 회수하여 파쇄한 세포 파쇄액에서의 HSAft-GFPuv 융합 단백질의 발현여부 및 정도를 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과 세포 배양액으로의 단백질 분비는 pYHSAft1-GFPuv 벡터로 형질전환된 재조합 균주에 의한 HSAft1-GFPuv 융합 단백질 분비 발현양이 가장 많았고 나머지 융합단편 발현체들은 서로 비슷한 양으로 분비 발현되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 한편 48시간 동안 배양한 세포의 파쇄액의 단백질을 정량하여 동량(10 μg)을 전기영동으로 전개하고 western blotting을 실시한 결과 세포 배양액과는 달리 pYHSAft1- GFPuv 벡터로 형질전환된 균주에 의한 HSAft1-GFPuv 융합 단백질 발현양이 가장 적었으며 나머지 융합단편 발현체들의 발현양은 서로 비슷하였다(Fig.
- 확보한 형질전환체 DHft1, DHft2, DHft3, DHft4를 YPM 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 후 배지로 분비 발현된 HSAft 단백질을 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, HSA 융합단편 1과 융합단편 2의 발현은 확인 할 수 없었으나 HSA 융합단편 3 그리고 전체크기 HSA 융합단편 4의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 상대적으로 크기가 작은 HSA 융합단편 1과 융합단편 2의 발현을 확인할 수 없었던 것은 융합단편의 저조한 발현에 기인하기 보다는 부적절한 접힘에 의한 분비 저하나 단백질 분해효소에 의한 선택적 분해 등에 기인할 것으로 사료된다[14].
- polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 (GFPuv)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다.
- 확보한 형질전환체 DHft1G, DHft2G, DHft3G, DHft4G를 YPM 액체 배지에서 배양하며 배지로 분비 발현된 HSAft-GFPuv 단백질을 공초점현미경을 이용하여 확인하였다. 배양한 세포를 공초점현미경으로 관찰한 결과 24시간 배양액에서는 4종류의 형질전환체 모두 녹색형광을 나타내는 것을 확인하였으나 전체적으로 그 세기가 약하였다(Fig. 3). 한편 48시간 배양액에서는 4종류의 형질전환체 모두 전체적으로 두드러지게 형광을 나타내었으며 각 형질전환체간의 형광세기도 비슷하였다(Fig.
- 3). 이 결과를 통해 길이가 짧은 HSA 융합단편 역시 효율적으로 GFP의 발현을 유도할수 있음을 확인할 수 있었다.
- 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 (GFPuv)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H.
- polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H.
후속연구
- 4B). 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 세트는 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현을 위한 융합단편의 신속한 선별을 가능하게 하며 나아가 숙주의 각종 단백질 발현 및 분비 경로의 대사공학적 재설계를 통해 해당 단백질의 최적 과발현 시스템 구축에 사용될 수 있을 것으로 기대된다[6, 12].
- 나아가 메탄올을 이용한 발현 시스템은 세포 생장과 발현유도를 동시 혹은 구분하여 배양에 따라서 임의로 쉽게 선택 할 수 있으며, 퍼옥시좀(peroxisome)이라는 미소체(microbody)가 형성될 때 이곳으로 타겟팅하여 발현함으로써 일부 재조합 단백질의 발현율 혹은 활성이 기존의 전통효모 발현 시스템보다 우수하여 효과적인 단백질 발현 시스템으로 주목받고 있다[4, 11, 22, 24, 25]. 이처럼 H. polymorpha는 단백질 발현 시스템으로서 야생형 자체로도 여러 장점을 갖고 있지만 추가적인 조작을 통해 재조합 단백질의 분비 능력을 향상시킴으로써 더 유용한 산업용 발현 시스템으로 개발 될 수 있다. 단백질 분비 효율을 증대시키는 기술은 재조합 유전자 발현 수준의 향상, 분비신호서열(signal sequence)의 최적화, 샤페론과 foldase의 발현, 단백질 분해효소의 활성저해, 세포벽 재설계 등이 있다[5, 27, 29].
- 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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