산업화 및 서구화에 따른 생활환경의 변화로 인해 면역력이 약한 어린이나 노약자를 중심으로 아토피 피부염, 천식 등의 알레르기 질환의 발병률이 크게 증가하고 있고 이에 대한 치료제 개발도 활발하게 이뤄지고 있다. 알레르기 치료제의 효능평가를 위해 개발된 기존의 알레르기 질환모델은 환경적 또는 유전적 요인 중 하나만을 감안한 모델로서 과민성 염증반응을 보이기는 하지만 질환의 정확한 병리현상을 대표하고 알레르기 질환을 유발하는 인간 유전자가 삽입된 인체 유사 질환모델동물은 거의 없다. 따라서 본 과제에서는 인체와 유사한 증상을 나타내는
산업화 및 서구화에 따른 생활환경의 변화로 인해 면역력이 약한 어린이나 노약자를 중심으로 아토피 피부염, 천식 등의 알레르기 질환의 발병률이 크게 증가하고 있고 이에 대한 치료제 개발도 활발하게 이뤄지고 있다. 알레르기 치료제의 효능평가를 위해 개발된 기존의 알레르기 질환모델은 환경적 또는 유전적 요인 중 하나만을 감안한 모델로서 과민성 염증반응을 보이기는 하지만 질환의 정확한 병리현상을 대표하고 알레르기 질환을 유발하는 인간 유전자가 삽입된 인체 유사 질환모델동물은 거의 없다. 따라서 본 과제에서는 인체와 유사한 증상을 나타내는 인간 유전자 삽입 알레르기 질환모델의 계통을 확립하고 의약품 효능 평가 모델로서의 유용성을 평가하고자 하였다. 이를 위해 본 과제에서는 첫째, 알레르기 질환의 대표적인 유전적 특징인 면역불균형을 유도하는 인간 GATA3 유전자가 삽입된 형질전환마우스를 생산 및 확인하였고 둘째, 실제 생산된 형질전환마우스가 정상마우스보다 알레르겐에 보다 민감하게 반응하여 알레르기 질환을 보다 잘 발현하는 지를 여러 표현형 지표를 통해 확인하였으며 셋째, 기존에 알려진 알레르기 질환 억제물질을 처치하여 발현에 변화를 보이는 지를 확인하였다. 본 과제를 통해 다음의 결과를 확보하였다. 첫째, 면역불균형을 유도하는 인간 GATA3를 삽입한 알레르기 질환모델 제작하였다. 미세주입기술로 pCMV/hGATA3가 삽입된 형질전환동물을 생산하였고 PCR 및 Southern blot으로 형질전환 여부를 확인하였다. Western blot을 통해 조직 특이적 발현을 확인하였고 C57BL/6와의 역교배를 통해 3세대까지 계통을 확립하였다. 둘째, 제작된 형질전환동물이 알레르기 질환모델동물로서 유용한지를 평가하였다. 염증부위인 귀의 두께 변화 분석, 혈청면역글로불린 농도 분석, 조직분석, MPO 활성도 분석, 이개 림프절 무게변화 분석, 피부건조?각질화 분석, 소양증 분석 등을 통해 인간 GATA3를 삽입한 형질전환동물이 정상동물보다 알레르겐에 보다 민감하게 반응하며 알레르기 질환이 심하게 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 알레르기 억제물질을 처치하여 20여종의 Cytokine 및 Chemokine에 대한 발현증상을 분석한 결과 인간 GATA3를 삽입한 형질전환동물에서 알레르기 질환 증상을 유도하는 Cytokine 및 Chemokine의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 인간 GATA3를 발현하는 형질전환동물은 정상동물보다 알레르기 질환이 쉽게 유도되며 알레르기 질환 억제물질에 의해 알레르기 질환 관련 단백질의 변화를 보였다. 따라서 본 연구를 통해 개발된 알레르기 질환모델동물은 알레르기질환의 발병에 영향을 미치는 인자들의 상호작용 및 발병 원리 규명을 위한 모델동물로 활용될 수 있을 것으로 보이며, 아토피?천식 치료 후보물질의 효능평가를 수행하는 연구기관 및 CRO에 평가모델동물로 제공되어 인간과 유사한 과학적 결과도출 유도하는 데 기여할 것으로 기대한다.
Abstract▼
Allergic diseases such as atopic dermatitis, asthma, and rhinitis are affected by environment. Recently, the diseases become a serious social problem with high incidence. However, there are no evident allergic disease model for evaluate the drug efficacy. The aim of this study was to develop transge
Allergic diseases such as atopic dermatitis, asthma, and rhinitis are affected by environment. Recently, the diseases become a serious social problem with high incidence. However, there are no evident allergic disease model for evaluate the drug efficacy. The aim of this study was to develop transgenic(Tg) animal expressing human GATA3 and confirm suitability as allergic disease model. It has been elucidated that enforced expression of the transcription factor GATA3 induces an imbalance in the ratio of type 1 helper T cells to type 2 helper T cells, which is thought to be indicative of pathogenesis of allergic disease such as asthma and atopic dermatitis. In this study, new 4 lineages of Tg mice were produced by the microinjection of pCMV/hGATA3 constructs into a fertilized mice eggs. The human GATA3 protein was successfully expressed in lymph node and thymus of the Tg mice. To induce allergic skin inflammation, the phthalic anhydride(PA) solution as chemical allergen was repeatedly spread on shaved dorsal skin and the ear’s dorsum of Tg mice and their littermate for 3 weeks. The ear thickness and skin score were measured prior to every allergen treatment. After 3 weeks, the weight of immune organs and the concentration of serum immunoglobulin were measured. Also, through histological staining, epidermis thickness and inflammatory cells number in ear section were evaluated. Based on an analysis of the allergic skin inflammation, ear thickness, skin score, draining auricular lymph node weight, epidermis thickness, inflammatory cell number, and serum immunoglobulin E and G1 concentration were significantly increased in the Tg mice compared with normal mice. Also, throu호 the mouse cytokine array assay, it is found out that allergy-related cytokine was suppressed when treated with allergy drug such as D-pinitol and Terreic acid. These findings suggest that the transgenic over-expression of human GATA3 enhances allergic skin inflammation by phthalic anhydride and can be used as allergic disease model for evaluating drug efficacy.
목차 Contents
최종보고서 ...1
요약문 ...2
Summary ...3
목차 ...4
제1장 연구개발과제의 개요 ...5
제1절 연구개발과제의 목표 ...5
1. 연구개발의 최종목표 ...5
2. 연차별 연구개발 목표 ...5
제2절 연구개발과제의 필요성 ...5
1. 알레르기질환의 정의 및 작용 기작 ...5
2. 인체 유사 알레르기질환 모델마우스 개발의 필요성 ...7
제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ...9
제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ...11
제1절 재조합 벡터의 제작 및 In vitro에서의 발현확인 ...11
제2절 형질전환마우스의 생산 및 확인 ...12
제3절 형질전환마우스의 유전적 계통확립 ...13
제4절 형질전환마우스의 조직 특이적 발현 분석 ...14
제5절 혈청분석, 염증반응, 피부건조.각질화, 소양증 분석 등을 통한 알레르기 질환평가 ...14
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