초록 ▼

1. 오염발생 특성 분석과 오염원 추적
포장돈육 가공장은 중부지역에 위치한 중소형가공장(80∼100두/일 처리) 2곳과 대형가공장(600∼800두/일 처리) 2곳을 선정하여 실험대상으로 하였다. 원료도체 입고에서부터 포장육 공정 완료시까지의 전 과정에 대한 원료도체, 돈육, 시설 및 장비, 환경에서 Listeria, Salmonella 균을 분리하고 RAPD 방법으로 오염의 특성을 분석하여, 위해미생물 오염원을 규명함으로써 근본적인 오염방지 대책을 마련하는데 필요한 자료를 제공하고자 하였다.
1) 공정조건 분석

1. 오염발생 특성 분석과 오염원 추적
포장돈육 가공장은 중부지역에 위치한 중소형가공장(80∼100두/일 처리) 2곳과 대형가공장(600∼800두/일 처리) 2곳을 선정하여 실험대상으로 하였다. 원료도체 입고에서부터 포장육 공정 완료시까지의 전 과정에 대한 원료도체, 돈육, 시설 및 장비, 환경에서 Listeria, Salmonella 균을 분리하고 RAPD 방법으로 오염의 특성을 분석하여, 위해미생물 오염원을 규명함으로써 근본적인 오염방지 대책을 마련하는데 필요한 자료를 제공하고자 하였다.
1) 공정조건 분석
포장돈육 가공시간은 15∼25분 정도이나 작업상황에 따라서는 2시간 이상 소요되는 경우도 있었다. 예냉실의 도체 온도는 평균 5.4℃였으나 1.0∼8.1℃의 온도범위를 보였다. 작업실 온도는 평균 18℃에 15∼25℃로 변화폭이 심하였다. 예냉실 온도관리는 HACCP 적용 이후 큰 어려움이 없을 것으로 예상되지만, 가공시간과 작업실 온도관리는 포장돈육 공정에서 변이 발생 소지가 높고 최종제품에서의 미생물 오염에 중요한 영향인자로 작용하므로 이들을 주요 controlling factor(CF)로 선정하였다.
2) 포장돈육 가공장의 오염발생 특성
(1) Listeria spp. 분리율과 혈청형
전체 782건의 시료에서 344건(44.0%)의 Listeria spp.가 분리되었고, L. innocua 210건(26.9%), L. monocytogenes 115건(14.7%), L. welshmeri 19건(2.4%)으로 분류되었다. 원료도체에서의 Listeria spp. 오염율은 22.7%, 가공중육에서는 35.2%, 최종육에서는 51.6%로 공정진행에 따라서 오염이 증가하고 있었다. 작업장내에서 돈육과 직접 접촉하는 장비인 도마, 칼, 장갑, 발골기, 박피기, 컨베이어벨트 등에서는 46.3%, 바닥과 벽 등의 환경에서는 54.7%가 검출되었다. 분리된 115건의 L. monocytogenes 혈청형은 serotype 1이 109건(94.8%)으로 대부분을 차지하였다.
(2) Salmonella spp. 분리율
전체 782건의 시료중 16건(2.0%)의 Salmonella spp.가 분리되었고, 도체 및 가공육에서 5건(2.0%), 작업환경에서 11건(2.1%)이 분리되었다. 포장돈육 가공장에서의 Salmonella 오염율이 낮은 이유는 Salmonella 오염발생이 주로 분변오염과 관련되는데 비해 포장돈육 가공장 작업환경은 분변오염 발생 가능성이 낮은 작업조건이기 때문이다. 따라서 fingerprinting 기법을 이용한 오염원을 추적하기에는 분리균주 수가 적어서 지표균으로 활용하기에는 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
(3) 작업전？중의 Listeria spp. 오염발생 양상
작업전에 이미 시설 및 장비에서 많은 오염이 검출되므로 작업전 세척소독 상태는 미흡한 것으로 파악되었다. 살균처리 공정이 없는 포장돈육 공정에서는 작업이 진행됨에 따라 교차오염으로 오염이 확대되어, 최종육에서의 오염수준이 높아지는 주요 원인으로 작용하고 있었다. 따라서 SOP에 준한 철저한 세척소독 실시가 중요하였다. 많은 가공장에서는 종사자가 작업중에 alcohol 분무기를 사용하여 사용중인 시설 및 장비를 소독하고 있지만, 그 효과에 대해서는 신뢰할 만한 근거를 찾기 어려웠다. 그 보다는 작업전의 철저한 세척소독이 더 근본적으로 관리되어야 할 사항으로 파악되었다. 작업장의 L. innocua 분리율은 L. monocytogenes보다 더 높았으며, 또한 같은 시료에서 동시에 검출되기도 하였지만, L. monocytogenes와 L. innocua 각각의 특징적인 오염양상을 나타내지는 않았다.
(4) HACCP 지정전？후의 Listeria spp. 오염수준 비교
최종육의 오염수준은 HACCP 지정작업장 16.7%, 비지정작업장 38.9%로 여전히 높아 HACCP 효과를 의심하게 하는 결과를 보였다. 도체의 오염은 근본적인 원인개선이 이루어지지 않아 오염이 반복되고 있었으며, 시설 및 장비와 환경에서의 오염 역시 제대로 관리되지 못하였다. 도체반입이 CCP로 설정되어 있지만, 모든 도축장이 HACCP 지정 작업장이므로 도체 반입시 입고검사는 거의 이루어지지 않았다. 특히 운송 중에 발생되는 오염에 대해서는 감시방법에 언급되지 않고 있다. 가공장 모두 세척？소독에 관한 위생관리 수칙을 갖고 있으나, 이를 제대로 준수하지 않거나 형식적인 작업으로 인하여 세척소독 효과에 대한 엄격한 관리가 요구되었다. 세척？소독관리는 CCP로 설정할 필요는 없지만, 제대로 관리되지 않는다면 CCP로 설정하여 관리를 강화할 필요성이 인정된다. 잘 계획된 HACCP 프로그램도 제대로 운영되지 않으면 HACCP 적용의 의미가 반감된다는 점도 본 실험을 통하여 확인할 수 있었다.
3) RAPD typing 결과를 이용한 가공장내 오염원 추적
Primer DG 122와 DG 107을 사용하여 L. monocytogenes 115균주를 분석한 결과 35종의 RAPD composite type이 관찰되었다. 가장 많이 분리되는 composite type은 Lm25로 50개의 분리주가 이 type에 속했으며 공정내 모든 시료에서 검출되었다. 분리주 L. innocua는 전체 210건이었고, 55종의 RAPD composition type이 관찰되어 L. monocytogenes 경우보다 더 다양한 composite type을 보였다. 가장 두드러진 composite type은 Li65로 77개의 분리주가 속했으며, 장비와 환경에서 가장 많이 검출되어 작업환경 내에 상존하는 균주로 추정되었다. Composite type의 흐름을 분석해 보면 최종 포장돈육의 오염발생은 두 가지 경로로 정리된다. 첫 번째는 원료도체에 오염된 외부유입 균주는 공정이 진행되면서 오염이 확대되어 최종돈육에 이르는 전공정에서 동일한 composite type이 검출되고 있으며, 두 번째는 작업환경에 상존하는 오염균은 작업과정에서 교차오염 발생으로 최종돈육을 오염시키고 있었다. 가공장내에 상존하는 위해미생물은 규정에 따른 세척소독의 철저한 준수와 시설 및 장비의 위생적인 관리 및 사용으로 그 오염을 대폭 낮출 수 있다고 판단된다. 더 중요한 국내 가공장의 현실적인 문제는 오염된 원료도체의 유입이라고 하겠다. 원료 도체로 인한 위해미생물 유입은 살균처리공정이 없는 포장돈육 공정의 안전성 관리에 치명적인 영향을 미치기 때문이다. 이미 국내 도축장은 HACCP을 적용하고 있으므로 대부분의 원료도체 오염은 도축장 반출 이후 가공장에 운송되는 과정에서 발생된다. 운송과정에 작업장과 냉동차량간 현수장치의 높이나 위치 등이 맞지 않아 도체 취급시 오염발생이 많으므로, 운송과정의 위생적인 관리대책이 시급하다고 하겠다. 또한 오염원 추적에는 L. monocytogenes만으로는 미흡하였고 L. innocua를 지표균으로 병행함으로써 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
2. Exposure assessment와 오염발생 예측시스템(MHEM)개발
Microbial risk assessment 원리를 기본적으로 활용하되 포장돈육 가공장에서 Salmonella spp.와 L. monocytogenes를 실험대상으로 하여, 작업현장 조건에 따른 위해 미생물 오염을 실시간으로 예측하는 오염발생 예측시스템을 개발하였다.
1) 오염발생 예측을 위한 기초 모델 개발
(1) Frame-work 모델 작성
원료도체 입고에서부터 최종육 저장까지의 연속된 경로를 대상으로 하되 작업장 공정조건 분석에서 나타난 CF를 중심으로 하고 원료도체의 초기오염수준단계(node 1), 포장돈육 공정에서의 성장 및 교차오염단계(node 2), 포장 후 유통되기 직전의 저장과정에서의 성장 단계(node 3)의 총 3개의 node로 구성하였다.
(2) 오염 전이율(TR) 분석 및 모델 개발
포장돈육 공정에서의 오염 전이율 분석은 Salmonella와 Listeria 균이 돈육 및 식품접촉면(스테인리스스틸, 컨베이어벨트, 도마)으로의 부착율 분석과 접촉 후 잔류 및 생존가능성에 대한 전이율 분석으로 구분하여 실시하였다. 부착율은 공정과정에 서 발생되는 돈육과 돈육, 돈육과 식품접촉면과의 부착상태를, 전이율은 원료도체간, 돈육간, 그리고 돈육, 종사자, 식품접촉면 상호간의 전이상태를 실험하였다. 이 결과를 바탕으로 독립변수로는 시간과 온도를, 종속변수는 전이율로 하는 2차 회귀모델을 산출하였고, 이 모델은 Microbial Hazard Exposure Model 개발에 이용하였다.
(3) 공정내 Salmonella spp., L. monocytogenes의 생존 및 잔류 분석
포장돈육 가공공정에서 직접 분리한 Salmonella spp., L. monocytogenes 야생균주를 이용하여 성장실험(온도; 0, 5, 10, 15, 20 ℃, 시간; 0, 1, 2, 3, 18, 48, 120시간)을 실시하였고, 이 결과를 Gompertz equation에 접목하여 포장돈육 공정조건에서 이들 균의 생존 및 잔류를 추정하는 성장예측모델을 작성하였다. 이 모델 역시 최종적으로 MHEl에 이용하였다.
2) 오염발생 예측시스템(Microbial Hazard Exposure Model)개발 및 평가
(1) Exposure simulation model 및 오염발생 예측용 소프트웨어 핵심기술 개발
돈육 및 포장돈육 공정에서의 위해미생물의 오염수준을 추정하기 위한 예측용 소프트웨어 핵심기술은 3개의 node로 구성되었고, CF를 바탕으로 입력변수와 출력변수를 포함하고 있다. 최초 입력변수로는 원료도체에서 위해미생물의 오염수준과 작업장 온도와 작업시간을 사용하였고, 최종 출력변수로는 포장 후 냉장저장 중 이들 위해 미생물의 생존율로 함으로써 출고되는 최종제품에의 오염수준을 추정할 수 있도록 구성하였다. 이 모델은 전이율모델, 성장예측모델 그리고 입력변수에 대한 확률분포모델들을 포함하고 있으며, 각각의 단계에서 이용된 수식과 입력변수는 Excel spreadsheet 프로그램으로 작성하여 simulation을 수행할 수 있도록 하였다.
(2) 포장돈육 가공장에 대한 Microbial Hazard Exposure Model 적용
개발된 Microbial Hazard Exposure Model을 이용하여 포장돈육 공정에 대한 simulation을 수행하였다. 최종 저장돈육에서의 Salmonella spp. 오염수준 변화는 공정을 거치면서 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. L. monocytogenes는 초기오염수준, 포장 후 오염수준, 최종 저장 후 오염수준 간에 많은 변화가 있었으며, 오염된 미생물은 저장기간 중에 약 30% 정도 성장하는 것으로 나타났다. 이는 포장돈육 공정에 서 L. monocytogenes가 Salmonella spp.보다 더 많이 오염될 수 있거나 성장할 수 있음을 의미하고 있다. Simulation 결과를 바탕으로 한 민감도 분석에서 Salmonella spp.는 민감도 수준이 낮았고 입력변수 간에 큰 차이가 없어 영향력이 낮았다. 반면 L. monocytogenes는 원료도체의 초기오염수준, 냉장저장시간, 가공시간이 상대적으로 높은 상관관계를 보여 이들 인자가 포장돈육 공정에서 위해미생물 관리의 critical control point에 해당되는 것으로 파악되었다. Salmonella spp.는 HACCP 적용 및 비적용작업장간의 공정별 그리고 최종돈육에서 뚜렷한 오염수준의 차이는 나타나지 않았다. 그러나 L. monocytogenes는 원료도체로부터 포장돈육에 이르기까지 전반적으로 HACCP 적용작업장에서 현저히 낮게 오염된 것으로 나타났다. 이는 작업장간의 위생관리 상태와 이로 인한 오염수준의 차이에 기인하는 것으로 판단된다.
(3) Microbial Hazard Exposure Model 평가
본 모델은 입력변수의 제한성이라는 현실적인 한계에도 불구하고, 영향력이 큰 변수인 초기오염수준, 작업장 온도, 작업시간을 이용하여 최종 포장돈육에서 Salmonella spp., L. monocytogenes의 오염수준을 실시간 예측을 가능하게 한다. 따라서 포장돈육 가공장의 안전성 관리에 활용 가능하며, 또한 본 모델은 포장돈육 공정에 대한 위해요소 평가와 관리에도 이용 가능할 것이다.
3. 위해미생물의 분류, 신속검출 및 정량화 기술개발
Listeria spp.와 Salmonella spp.를 대상으로 현장에서 활용 가능한 typing 및 검출, 정량방법을 개발하기 위해서 fingerprinting 기법을 보완하고 신속검출 및 신속정량방법을 개발하였다. ERIC fingerprinting, Ribotyping-PCR, RAPD, SSCP, PFGE 등의 방법을 비교함으로써 fingerprinting 방법을 보완하였다. Listeria의 경우 RAPD를 단독으로 행할 경우는 ERIC fingerprinting이나 Ribotyping-PCR보다 분리력이 뛰어나 typing에 적합한 것으로 판단되었으나, 비교에 사용한 Listeria 표준균주 13종을 모두 구별하지는 못하였다. 그러나 DG122 (Lis 11)를 이용한 RAPD 결과와 Ribotyping-PCR 결과를 병행하여 사용하거나, DG107과 DG122를 이용하여 각각 RAPD를 한 결과를 composite하면 13가지 Listeria를 모두 구별할 수 있었다. Salmonella 경우도 RAPD, ERIC, ribotyping-PCR, SSCP 등을 단독으로 행할 경우는 57가지 표준균주를 모두 구별하지는 못하였다. 그러나 primer 1 또는 primer A를 사용하여 RAPD를 행한 결과와 ERIC을 composite하면 표준균주 57가지를 모두 구별 할 수 있었다. 검출방법 개발에서 L. monocytogenes, Salmonella spp.를 특이하게 검출하는 유전자로는 hlyA, invA를 각각 이용하였다. 오염된 L. monocytogenes, Salmonella spp.를 신속히 정량하는 방법으로는 competitive PCR을 이용하였다. Copy 수를 알고 있는 standard DNA와 돈육으로부터 분리한 L. monocytogenes DNA 또는 Salmonella DNA를 함께 증폭시켜 전기영동을 행함으로써 오염된 L. monocytogenes 또는 Salmonella의 colony forming unit를 약 5시간 이내로 추산할 수 있었다. L. monocytogenes 경우 hlyA gene을 cloning하여 148 bp를 delete하여 standard로 사용하였다. L. monocytogenes에 오염된 돈육 추출물 0.1g으로부터 검출 할 수 있는 한계는 약 860 colony forming unit이었다. Salmonella 경우는 invA gene을 cloning하여 82 bp를 delete하여 standard로 사용하였고, 오염된 돈육 추출물 0.1 g으로부터 검출할 수 있는 한계는 약 700 colony forming unit이었다.

Abstract ▼

1. Patterns of contamination and tracing the sources.
This study was performed to characterize the patterns of contamination and to trace the fundamental sources of contamination of Listeria spp. and Salmonella spp. in pork processing plants using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Sampl

1. Patterns of contamination and tracing the sources.
This study was performed to characterize the patterns of contamination and to trace the fundamental sources of contamination of Listeria spp. and Salmonella spp. in pork processing plants using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Samples were collected from carcass, pork on processing, surfaces of equipment and environment from two small plants (80∼100 carcasses processing/day) and two large plants (600∼800 carcasses).
1) Survey on the procedure condition in pork processing plant
The results of survey showed that processing time was a minimum of 15 minutes and usually 25 minutes, but it took two hours in some case. The temperature of inner pork carcass appeared 5.4℃ as a mean value, including a minimum of 1.0℃ and maximum of 8.1℃. The processing room temperature was 18℃ as a mean value, including minimum 15℃ and maximum 25℃. Processing time, processing room temperature which showed high variability were selected as controlling factors.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...3
• 요약문...4
• SUMMARY...12
• Contents...18
• 목차...20
• 제1장 서론...24
• 제1절 연구개발의 필요성...24
• 제2절 연구개발의 목표...25
• 제3절 연구개발의 내용...27
• 제2장 국내외 기술개발 현황...30
• 제1절 해외의 관련연구...30
• 1. MRA/Exposure assessment ...30
• 2. MRA/QRA 최근 연구동향...31
• 3. Molecular typing과 정량화 분석 기술...32
• 제2절 국내의 관련연구...33
• 제3절 현 기술상태의 취약성...33
• 제4절 본 연구결과의 의미...34
• 제3장 작업장의 오염발생 특성 및 오염원 분석...36
• 제1절 공정조건 분석...37
• 1. 포장돈육 작업공정 분석...37
• 2. 작업환경 분석...40
• 제2절 실험재료 및 방법...42
• 1. 실험대상 작업장 선정...42
• 2. 시료채취 및 방법...43
• 3. Listeria 분리 및 동정...43
• 4. Salmonella 분리 및 동정...44
• 5. DNA 분리 정제...44
• 6. RAPD-polymerase chain reaction(PCR) 조건...47
• 제3절 오염발생 특성분석...48
• 1. 포장돈육 가공장에서 Listeria spp.의 분리율...48
• 2. 혈청형별 Listeria monocytogenes의 분포...50
• 3. 포장돈육 가공장에서 Salmonella spp.의 분리율...53
• 4. 작업전.중의 Listeria spp. 오염발생 양상...57
• 5. HACCP 지정전.후의 Listeria spp. 오염수준 비교...63
• 제4절 포장돈육 가공장의 오염원 추적...70
• 1. L. monocytogenes의 RAPD typing...70
• 2. Listeria innocua의 RAPD typing...78
• 3. RAPD typing 결과를 이용한 가공장내 오염원 추적...84
• 제4장 Exposure assessment와 오염발생 예측 모델 개발...90
• 제1절 Frame-work 모델 작성...91
• 1. 입력변수 선정...91
• 2. Frame-work 모델 구성...91
• 3. Frame-work 모델 활용...91
• 제2절 Controlling factor에서의 오염 전이율(TR) 분석...95
• 1. 서론...95
• 2. 실험적 접근방법...95
• 제3절 공정내 위해미생물 생존 및 잔류 분석...146
• 1. 서론...146
• 2. 실험적 접근 방법...146
• 3. 결과...151
• 제5장 오염발생예측시스템(Microbial Hazards Exposure Model) 개발 및 평가...168
• 제1절 오염발생 예측용 소프트웨어 핵심기술 개발...168
• 1. 모델 핵심기술 구성 개요...168
• 2. 확률분포 모델 선정...168
• 3. 핵심기술 구성...170
• 제2절 포장돈육 가공장에 대한 Microbial Hazard Exposure Model 적용...175
• 1. 적용 방법론...175
• 2. 모델을 이용한 포장돈육공정의 Salmonella, L. monocytogenes 오염수준 평가...176
• 제3절 Microbial Hazard Exposure Model 평가...205
• 1. 모델 검증...205
• 2. 모델 평가...208
• 3. 모델 활용...209
• 제6장 위해미생물의 분류, 신속검출 및 정량화 기술 개발...212
• 제1절 위해미생물의 molecular typing을 위한 fingerprinting 기술보완...213
• 1. 재료 및 방법...213
• 2. Listeria의 특성분석을 위한 molecular typing 방법의 상호보완...219
• 3. Salmonella 특성분석을 위한 molecular typing 방법의 상호보완...227
• 제2절 위해미생물의 신속검출 및 정량화 기술개발...237
• 1. 재료 및 방법...237
• 2. 돈육에서의 L. monocytogenes 검출...242
• 3. 돈육에서의 오염된 Salmonella 검출...246
• 4. Competitive PCR을 이용한 돈육에서 L. monocytogenes 정량...252
• 5. Competitive PCR을 이용한 돈육에서 Salmonella 정량...254
• 제7장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...256
• 제8장 연구개발결과의 활용계획...260
• 제9장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...262
• 제10장 참고문헌...263