초록 ▼

인플루엔자 백신의 항원 함량은 인플루엔자 바이러스의 주항원인 헤마글루티닌(HA) 함량을 기준으로 한다. SRID 방법은 매우 specific하고 백신의 HA 함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이며, sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다. 또한 이 방법에서 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하는 데에 2~3개월이 소요되기 때문에 판데믹 상황 시 신속한 백신 개발에 걸림돌이 되기도 한다. 따라서 본 연구에서

인플루엔자 백신의 항원 함량은 인플루엔자 바이러스의 주항원인 헤마글루티닌(HA) 함량을 기준으로 한다. SRID 방법은 매우 specific하고 백신의 HA 함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이며, sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다. 또한 이 방법에서 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하는 데에 2~3개월이 소요되기 때문에 판데믹 상황 시 신속한 백신 개발에 걸림돌이 되기도 한다. 따라서 본 연구에서는 이 SRID법을 대체할 수 있는 SE-HPLC를 이용한 HA 함량 측정법을 개발하고자 하였다. SE-HPLC 방법은 분석이 간단하면서도 빠르고, 표준항체가 필요하지 않으며 기존의 표준항원으로도 분석이 가능하기 때문에 HA 함량을 빠르게 측정하여 백신 개발에 필요한 시간을 단축하는데 큰 도움이 될 수 있다.
본 연구에서는 SE-HPLC를 이용하여 NIBSC 표준항원인 A/California/7/2009 (H1N1)v (NYMC-X179A) (NIBSC code: 09/146), (주)녹십자의 2009년 H1N1 판데믹 백신인 그린플루-에스, 2010년 계절 인플루엔자 백신인 지씨플루, 2010 계절 인플루엔자 백신의 단가원액 H1N1, H3N2, B에 대한 분석을 각각 수행하였다. 컬럼은 TOSOH사의 G3000SWxl을 사용하였고, 표준항원과 백신의 elute를 받아 Western blot, ELISA, SRID 실험을 수행한 결과와 표준항원 및 백신의 immunoprecipitation(IP) 실험 결과를 종합하여 크로마토그램에서의 HA peak의 위치와 분리 시간을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 SE-HPLC 방법을 이용하여 표준항원과 각 인플루엔자백신을 분석하고, 그 둘의 HA에 대한 크로마토그램 면적비로 백신의 HA 함량을 구하였다. 시험법의 재현성과 반복성을 확인하기 위해 10개의 서로 다른 생산 Lot별 그린플루-에스를 날짜를 달리하여 3일 간 분석을 수행하고, 표준항원과 백신의 HA 면적비를 측정하고 비교하여 재현성 있는 결과를 얻었다. 또한 3번씩 측정하여 반복성을 확인하였다.
표준항원 A/California/7/2009과 백신에 대하여 1 ${\mu}g$ 당 SE-HPLC 면적을 측정하고 그 둘의 면적비를 구한 결과 1: 1.16의 비율을 나타내었다. 따라서, 실제 백신에 포함되어 있는 HA 함량은 표준항원과 백신의 면적으로 계산된 HA 함량을 이 면적 비율로 나눈 값으로 추정할 수 있다.
단, 이번 연구는 동일한 제조공정으로 제조한 2년 동안의 H1, H3, B 등 3가지 바이러스 type에 대한 제한적인 정보를 담고 있다. 다양한 type의 바이러스에 대한 추가적인 연구와 특히, H5N1 등 판데믹 인플루엔자를 유발할 것으로 예상되는 조류 인플루엔자 바이러스에 대해서도 추가적인 누적된 분석결과가 필요하다.

Abstract ▼

Influenza is a virus that infects 15 % of the world population annually and causes approximately 500,000 deaths. Haemagglutinin(HA) is a major viral antigen of influenza, and a potency of influenza vaccine depends on a content of HA. Although single radial immunodiffusion(SRID) method is very specif

Influenza is a virus that infects 15 % of the world population annually and causes approximately 500,000 deaths. Haemagglutinin(HA) is a major viral antigen of influenza, and a potency of influenza vaccine depends on a content of HA. Although single radial immunodiffusion(SRID) method is very specific and unique method that can be used to measure content of HA in influenza vaccine visually, it needs long time and is very labor-intensive, less sensitive, less accurate and less precise. Also, this method is hindrance to develop the vaccine rapidly because making standard antigen and antibody used in SRID assay takes several months. Therefore, size exclusion-high performance liquid chromatography(SE-HPLC) method is developed to replace SRID. SE-HPLC method is simple and fast. In addition, it can help rapid development of vaccine because it does not require a standard antibody and can be utilized for analysis of HA using existing standard antigen. In this study, A/California/7/2009 (H1N1)v (NYMC-X179A) which is a standard antigen produced by NIBSC and Greenflu-S, 2009 H1N1 pandemic vaccine, GC flu that is 2010 seasonal vaccine, 2010 monovalent of seasonal vaccine H1N1, H3N2 and B provided by GreenCross corporation were analyzed by SE-HPLC method, and G3000SWxl column(TOSOH) was used. To ascertain presence of HA and location of HA peak, elute of each material was analyzed by western blot, enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and SRID technique, and vaccine and standard antigen were used for performing immunoprecipitation(IP). Based on these results, standard antigen and vaccine were analyzed by SE-HPLC, and the content of HA were determined by area ratio of both. In order to validate SE-HPLC method, reproducibility and repeatability were measured using different ten lots of Greenflu-S. Reproducibility was performed on different three days by SE-HPLC method. Reproducible results in three days were obtained by measuring area ratio of HA of standard antigen and vaccine and comparing each other. Moreover, repeatability was checked by testing same lots of Greenflu-S in triplicate. Areas per 1 ${\mu}g$ of A/California/7/2009, standard antigen, and vaccine were determined by SE-HPLC, and area ratio of both was 1: 1.16. Therefore, HA potency in vaccine can be estimated that content of HA calculated by areas of standard antigen and vaccine is divided by this ratio. This study contains restrictive information about three kinds of virus types produced by same process such as H1, H3 and B in two years. Additional research about various viruses and the avian influenza virus like H5N1 expected to cause pandemic influenza is needed.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서...1
• 표지...2
• 요약문...3
• Summary...4
• 목차...5
• I. 연구개발과제 연구결과...6
• 제1장 연구개발과제의 개요...6
• 제2장 연구개발과제의 국내ㆍ외 연구개발 현황...8
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과...9
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...28
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...30
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획...31
• 제7장 참고문헌...32