초록 ▼

인플루엔자 바이러스는 연간 세계 인구의 15 %를 감염시키고 500,000명의 죽음을 야기하는 바이러스다. 이 바이러스의 주항원은 헤마글루티닌으로 인플루엔자 백신의 역가는 헤마글루티닌의 함량을 기준으로 한다. SRID 방법은 매우 specific하고 백신의 헤마글루티닌의 함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이며, sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다. 또한 이 방법에서 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하

인플루엔자 바이러스는 연간 세계 인구의 15 %를 감염시키고 500,000명의 죽음을 야기하는 바이러스다. 이 바이러스의 주항원은 헤마글루티닌으로 인플루엔자 백신의 역가는 헤마글루티닌의 함량을 기준으로 한다. SRID 방법은 매우 specific하고 백신의 헤마글루티닌의 함량을 시각적으로 측정할 수 있는 현재 유일한 방법이지만, 시간이 오래 걸리고 처리량에 비하여 매우 노동 집약적이며, sensitivity, accuracy, precision이 비교적 떨어진다는 단점이 있다. 또한 이 방법에서 사용되는 표준항원과 표준항체를 개발하는 동안 2～3개월이 소요되기 때문에 인플루엔자 대유행시 신속한 백신 개발에 걸림돌이 되기도 한다. 이에 ‘11년 자체 연구 사업을 통해 “RP-HPLC를 이용한 인플루엔자 백신 중 헤마글루티닌 함량시험법”을 개발하였다. 올해는 이 시험법을 백신 제조사에서 실제로 적용하여 ’12년 생산 백신 원액 중 헤마글루티닌 함량을 측정하였고, 그 결과와 기존의 SRID 시험법 결과와의 상관관계를 관찰하였다. 두 개의 백신 제조사에서 자사제조 계절백신원액에 적용한 결과 표준시험법인 SRID 시험결과와 밀접한 상관관계를 나타내었다. 이번연도 연구에서는 또, ‘11년 확립된 분석방법 중 개선 가능한 요소에 대해 개선사항을 반영하여 시험법을 최적화 하고자 하였고, 계절인플루엔자 3개 strain모두에 적용 가능한 분석방법을 확립하고자 노력하였다. 먼저 분석감도를 높이기 위하여 분석조건 중 detector를 UV(214 nm)에서 형광(Ex 280 nm, Em 330 nm) detector로 변경하였다. 그 결과 이전 분석법에 비해 검출한계가 약 400배 이상 향상되었다. 또 계절인플루엔자 3가지 strain(H1N1, H3N2, B)에 모두 적용 가능한 분석조건 확립을 위하여 여러 번의 시행착오를 거쳐 이동상 gradient 조건을 확립할 수 있었다. 그 결과 약 13분대의 HA1 피크를 분리하였으며 western blotting 시험을 통해 확인하였다. 확립된 시험법의 밸리데이션을 위하여 각각 특이성, 직선성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 측정하였다. 그 결과를 볼 때, 헤마글루티닌 함량에 따른 HA1 피크면적에서 상관계수가 0.99이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. 전처리 과정을 거친 시료를 6번 분석한 결과, 피크면적과 피크유지시간에 대한 상대표준편차값이 5 %이하를 나타내어 훌륭한 정밀성을 나타내었다. 확립된 시험법에 따라 헤마글루티닌 함량 검량선을 작성한 뒤 계절백신단가원액 각 10로트(H1N1, H3N2), 2로트(B)의 헤마글루티닌 함량을 측정한 결과, 백신단가원액의 헤마글루티닌 함량은 SRID로 측정한 결과와 비교할 때 밀접한 상관관계를 나타내었다. 이번 연구로 개발된 RP-HPLC 시험법은 기존 SRID 시험법에 비해 신속·정밀하며, 이를 실제 백신 생산현장에서 적용하는 과정을 통해 개선점을 보완하고, 광범위한 모니터링을 통해 시험법에 대한 신뢰성을 확립한다면, 인플루엔자 대 유행시에 국제기관에서 분양되는 표준물질을 기다리지 않고 보다 신속하게 백신의 제조 및 임상시험이 가능하게 되어 국민보건에 기여할 수 있을 것으로 사료된 다. 아울러 이 시험법은 백신 제조공정의 consistency를 확인하는 시험법으로 SRID시험법을 대체할 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Influenza is a virus that infects 15 % of the world population, causing 500,000 deaths annually. Haemagglutinin(HA) is a major antigen of this virus, and the potency of influenza vaccine is based on the content of HA. Although single radial immunodiffusion(SRID) is a very specific and unique method

Influenza is a virus that infects 15 % of the world population, causing 500,000 deaths annually. Haemagglutinin(HA) is a major antigen of this virus, and the potency of influenza vaccine is based on the content of HA. Although single radial immunodiffusion(SRID) is a very specific and unique method that can be used to measure the HA content in influenza vaccine visually, it needs a long time and is very labor-intensive, less sensitive, less accurate and less precise. Also, this method can be a hindrance to develop the influenza vaccine rapidly because it takes several months to prepare standard antigen and antibody used in SRID. Against this backdrop, Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography(RP-HPLC) method was developed to measure the HA content in influenza vaccines in 2011. In this study, this method was applied to measure the HA content of bulk vaccine made by vaccine manufacturer in 2012, and a correlation with SRID was determined. Two manufacturers measured HA content of seasonal bulk vaccine by using RP-HPLC method, and the result showed that the content determined by RP-HPLC and SRID had a close correlation. Moreover, this year' s study tried to optimize the method by reflecting some improvements from a method established in 2011, and to establish method which could be applied to all three strains of seasonal influenza vaccines. First, fluorescence detector(Ex 280 nm, Em 335 nm) was used instead of UV detector(214 nm) in order to improve sensitivity. As a result, limit of detection(LOD) was improved 400 times than that of the old method. Also, mobile phase gradient condition was developed by several trials and errors to establish analysis condition applicable to 3 strains of seasonal influenza(H1N1, H3N2, B). Consequently, HA1 peak was separated at around 13 min, and checked by western blotting. Specificity, linearity, accuracy, precision and LOD·LOQ were measured to validate the method. This method had great linearity that a correlation factor was over 0.99 between haemagglutinin content and HA1 peak area. In addition, superior precision of this method was obtained by analyzing pretreated sample 6 times, and relative standard deviation(RSD) of peak area and retention time was less than 5 %. After creating a calibration curve according to validated RP-HPLC method, the HA content of seasonal monovalent bulk vaccine 10 lots(H1N1, H3N2) and 2 lots(B) were calculated, and there was a close correlation between the two results measured by RP-HPLC and SRID. Our results showed that the RP-HPLC method is more rapid and has good precision. If the improvements that are occurred by applying to vaccine manufacturing field are complemented, and the reliability is established through large scale monitoring of this method, RP-HPLC method can be used promptly when influenza reference material is not available in influenza pandemic situation. In addition, this method can be altered SRID as a method checking consistency of vaccine manufacturing process.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 표 지 ... 2
• 요 약 문 ... 4
• Summary ... 5
• 목 차 ... 6
• Ⅰ. 연구개발과제 연구결과 ... 7
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
• 제2장 연구개발과제의 국내 • 외 연구개발 현황 ... 11
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 13
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 36
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 37
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 38
• 제7장 참고문헌 ... 39
• 제8장 첨부서류 ... 40