초록 ▼

본 연구의 내용은 국내 엽채류에서 발견되는 주요 병원성 미생물의 genotyping을 통하여 엽채류에서 주요 병원성 미생물을 검출할 수 있는 primer 개발하고, PNA chip, 항원-항체반응 등분자생물학적 방법을 통해 신속 검출기법을 개발하는데 있다.
1. PNA 칩 이용한 식중독균 검출기법 개발
신선 농식품에 오염가능성이 있는 대상 식중독균을 최종 8종을 가지고 실험을 진행하였다. 식중독균 특이적인 유전자 선발과 프라이머 디자인 및, PNA칩의 특이 신호 증폭을 위한 Asymmetric PCR조건 확립하였다. 식중

본 연구의 내용은 국내 엽채류에서 발견되는 주요 병원성 미생물의 genotyping을 통하여 엽채류에서 주요 병원성 미생물을 검출할 수 있는 primer 개발하고, PNA chip, 항원-항체반응 등분자생물학적 방법을 통해 신속 검출기법을 개발하는데 있다.
1. PNA 칩 이용한 식중독균 검출기법 개발
신선 농식품에 오염가능성이 있는 대상 식중독균을 최종 8종을 가지고 실험을 진행하였다. 식중독균 특이적인 유전자 선발과 프라이머 디자인 및, PNA칩의 특이 신호 증폭을 위한 Asymmetric PCR조건 확립하였다. 식중독균을 감별하기 위한 유전자 부위 ITS (Internal transcribed spacer) region을 정하였으며 E. coli O157:H7의 경우 ITS부분이 가능하지 않아 per gene을 사용하였다. 2차에 걸친 후보군 probe 에 대한 선별과정을 통해 비특이적인 반응을 나타내지 않고 특이 반응 signal intensity 가 가장 높은 probe를 최적 probe 로 선정하였다. 결과 분석은 PNA chip image 와 probe 마다의 signal intensity 에 대한 background 와의 ration SBR 분석을 통하여 positive probe 확인 후 대상 균주를 확인하는 방법으로 수행하였다. PNA Chip 디자인 및 최적의 hybridization 반응 조건은 Formamide 10%, 40℃, 1시간이 가장 좋았다. 농산물에의 적용시험은 먼저 E. coli O157, S. enterica, L. monocytogens, S. aureus, B. cereus, Y. enterocolitica를 대상으로 채소 종류와 식중독균 접종 농도에 따른 회수률을 평가하였다. 다양한 농도로 회수된 식중독균의 PCR 증폭 가능 농도를 평가한 결과 4log에서 가능하였으나 4 log 정도의 가능성으로는 농산물에서의 식중독균의 진단이 매우 어렵다. 농산물에서의 식중독세균 회수율을 증가하기 위하여 6 시간 증균을 하였고 nested PCR을 첨가하여 fragment를 증폭하면 2 log 감염도 진단이 가능하였다. 농가나 조그만 마트 등에서는 이미 알 고 있는 균의 존재 여부만 알고자 할 경우에 FISH란 방법을 사용하여 간단하게 진단할 수 있다. E. coli 0157:H7 과 salmonella enterica를 중심으로 probe를 제작하고 labelling 하였다. PNA probe 가 순수한지 알아보기 위하여 HPLC를 사용하여 확인하였다. Labelling 된 probe 의 순수성을 MALDI-TOF를 이용하여 체크하였다. 위의 제작된 probe를 이용하여 다음의 방법으로 FISH 진단을 하였으며 4 log 까지는 단순 형광현미경으로 진단이 가능하였다.

Abstract ▼

Pathogen detection is an important issue in human health because several food pathogens threat people by severe communicable diseases. Several methods have been studied in this project.
1. PNA microarray
In order to detect the pathogenic bacteria on vegetables, 8 important aerobac bacteria had

Pathogen detection is an important issue in human health because several food pathogens threat people by severe communicable diseases. Several methods have been studied in this project.
1. PNA microarray
In order to detect the pathogenic bacteria on vegetables, 8 important aerobac bacteria had been selected. Individual pathogenic bacterial speicific primers were designed usng bacterial ITS region only, but specific primers was not abailable for E.coli 0157:H7, per gene was selected for the primers for E.coli 0157:H7. Asymmetric PCR had been adapted for the amplification of specific DNA fragment for individual pathogens. Several candidate primers were selected for individual pathoges and several tested had been done for the specificity and final set for the probe were decided using PNA chip image, signal intensity, and ration SBR compared to background. Optimal condition for hybridization was Formamide 10%, 40℃, for 1 hour. Since the number of contaminated pathogens were small, the recovering bacteria from vegetables was a hurdle for the successive result. Six hours incubation just after harvest and nested PCR increased the number of pathogens and resulted in clear detection signal. Using this methods, we were able to detect 2 log pathogens contaminated on lettuce. Besides PNA chip, fluorescens in situ hybridization (FISH) is a easy and hady method to detect single possible pathogen. Using PNA probe labelled with florescens, we were able to detect E. coli 0157:H7 or Salmonella enterica within 2 hours using simple fluorescens microscope.
2. Study of Genetic diversity
Staphylococcus aureus is recognized as a globally important pathogen in food-borne disease. We investigated the prevalence of these organisms in samples from humans (n=38), livestock production (n=36), food (n=9) and leaf vegetables (n=55). The purpose of this study was to group S. aureus isolated from various Korean origins. To study genetic diversity among the isolates, genes associated with virulence, antibiotic susceptibility, and genetic relationships were analyzed using PCR, the disk diffusion method, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• 제 1 장 서론 ... 8
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 8
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 10
• 제 1 절 세계적 수준 ... 10
• 제 2 절 국내수준 ... 10
• 제 3 절 국내외 연구현황 ... 11
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 12
• 제 1 절 PNA 칩 이용한 식중독균 검출기법 개발 (제1세부과제) ... 12
• 제 2 절 유전자 이용한 식중독균 신속 검출 기법 개발 (제2세부과제) ... 26
• 제 3 절 항체를 이용한 식중독균 검출기법 개발 (제1 협동과제) ... 39
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 50
• 제 1 절 목표대비 달성도 ... 50
• 제 2 절 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타) ... 51
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 55
• 제 6 장 중요 변동사항 ... 55
• 제 7 장 참고문헌 ... 55
• 유전자자와 항체를 이용한 농식품중 식중독균 진단법 개발 ... 57
• 주요 결과 요약서 ... 58