초록 ▼

세포융합은 유전체 불안정성을 야기할 수 있는 이론적 원인 중 하나이며 그 현상이 여러 in vitro, in vivo model system에서 확인되고 있음. 본 연구는 암세포간의 융합이 유전체불안정성을 야기함으로써 암의 진행에 있어 하나의 동인이 될 것이라는 가설을 갖고 출발하였음.
이러한 가설 하에 암세포 간 융합에 의해 초래된 유전체 불안정성이 세포의 운명과 암의 진행에 미치는 영향을 확인하며 유전체 불안정성에도 불구하고 생존, 증식하는 융합세포의 분자 profile을 확인함으로써 항암치료의 새로운 표적분자를 제시함을

세포융합은 유전체 불안정성을 야기할 수 있는 이론적 원인 중 하나이며 그 현상이 여러 in vitro, in vivo model system에서 확인되고 있음. 본 연구는 암세포간의 융합이 유전체불안정성을 야기함으로써 암의 진행에 있어 하나의 동인이 될 것이라는 가설을 갖고 출발하였음.
이러한 가설 하에 암세포 간 융합에 의해 초래된 유전체 불안정성이 세포의 운명과 암의 진행에 미치는 영향을 확인하며 유전체 불안정성에도 불구하고 생존, 증식하는 융합세포의 분자 profile을 확인함으로써 항암치료의 새로운 표적분자를 제시함을 목표로 하였음. 구체적으로 가. 융합된 세포의 운명 확인, 나. In vitro 및 in vivo model system에서 암세포간의 융합과 암의 진행 간의 관련성 확인, 다. 융합세포의 생존을 가능케 하는 요소를 추적하여 항암치료의 표적분자로서의 가능성 확인을 연구 목표로 갖고 세 방향으로 일을 진행하였음. 그 결과는 아래와 같음.
가. 융합된 세포의 운명 확인
전기자극을 통해 HeLa 세포를 융합한 후 융합된 세포와 융합되지 않은 세포를 FACS sorting으로 분리하여 비교하면서 실험 함 (이하 R3;융합세포), R2;비융합세포). 융합 직후 세포의 증식과 사멸을 확인한 결과 융합 후 3일 이후부터 R2와는 달리 R3의 세포사멸율이 30% 이상에 달하였으며 이러한 대량 세포사멸 현상은 융합 후 7일 경까지 관찰되다가 점점 감소함. 이 시기와 일치하여 세포의 수가 증가하기 시작함을 볼 때 융합세포는 융합이후 대량의 세포사멸을 겪고, 이 과정에서 살아남은 세포는 parental cell과 유사한 정도의 세포증식능을 보임을 알 수 있음. 이 현상은 limiting dilution 후 각 융합세포의 운명을 시간에 따라 관찰하였을 때도 역시 확인할 수 있었음. 세포사멸이 caspase 저해제에 의해 억제되며, PARP cleavage, caspase 3 활성화 등이 동반됨을 볼 때 apoptosis가 일어나고 있음을 확인하였음.
융합 후 처음에는 핵의 크기, 8번 염색체의 숫자, centrosome 숫자 등에 있어 세포간에 커다란 편차를 보이지만 시간이 지남에 따라 각각의 수치들이 일정한 범위로 수렴함을 생각할 때, 유전체불안정성이 극심한 세포들이 사멸에 빠지기 때문에 대량의 세포사멸이 일어나는 것으로 생각됨.
한편 stable clone으로 확보된 R3 세포의 특성을 확인한 결과, 세포분열 과정 중 multipolar spindle의 증가, lagging chromosome의 증가 등 유전체불안정성 증가 소견을 보였으며 이는 8번 염색체를 표적으로 하는 FISH 방법으로 수행한 CIN assay (chromosomal instability assay)에 의해서도 확인됨. 그 원인 중 하나로 centrosome 수의 증가가 확인됨.
결론적으로, 암세포를 융합하였을 때 융합세포들은 대량의 세포사멸을 겪고 나서 일부 세포들이 정상적으로 증식하게됨. 안정적으로 증식하는 융합세포들은 비융합세포에 비해 유전체불안정성이 증가하는 경향을 갖게 되며 그 이유 중 하나로 centrosome의 증가를 들 수 있음.
나. In vitro 및 in vivo model system에서 암세포간의 융합과 암의 진행 간의 관련성 확인
Agarose colony generation assay 결과 예상과 달리 R3 clone의 colony 수와 크기가 R2에 비해 더 작았음 (이때 clone 간의 variation이 큰 것으로 보아 유전체불안정성이 커진 것과 일맥상통함). 실제 nude mouse를 이용한 in vivo tumorigenesis assay에서도 R3 clone이 암발생을 촉진하지는 않았음. 세포융합 후 tumor progression의 측면에서 기대했던 결과가 없어 유전체불안정성이 증가하였다는 점에 착안하여 cisplatin에 대한 저항성 획득능을 R3와 R2에서 비교하였음. 실망스럽게도 R3와 R2 간에 차이를 볼 수 없었음. 다만 cell migration assay에서 R3 clone이 R2 clone에 비해 migration을 더 잘함을 확인하여, 현재 그 이유를 찾는 실험을 진행하고 있음.
결론적으로, 융합된 암세포들이 더 암화 되었다는 증거를 발견할 수 없었음. 다만 세포의 이동성이 유의하게 증가한 것을 확인하고 그 기전과 의미를 탐색하고 있음.
다. 융합세포의 생존을 가능케 하는 요소를 확인
융합세포의 생존과 관련하여 p53 response의 차이를 확인하였으나 R3와 R2 간에 차이가 없었음. 한편, apoptosis와 관련된 단백질들의 발현 변화를 확인한 결과, survivin 단백질의 발현양이 R3 clone 전부에서 증가하였으며, 융합 직후 대량의 세포사멸이 진행되는 상황에서도 survivin 의 증가현상을 관찰할 수 있었음.
현재 survivin이 융합 이후 세포사멸에서 escape하도록 하는 중요 분자인지 확인하는 작업을 진행하고 있음.
또 다른 접근방법으로 R2 pool, R3 pool에 대한 microarray와 각 clone에 대한 RNA sequencing 을 수행하여 공통적으로 발현 증가 혹은 감소된 유전자들을 확인함. Real-time PCR 수행 결과 13종의 발현증가 유전자와 2종의 발현 감소 유전자를 확인하고 현재 단백질 발현 변화 여부와 융합세포에서의 발현변화의 의미에 대해 연구를 진행하고 있음.
결론적으로 융합후 생존세포에서 survivin 의 증가를 관찰하고 그 의의에 관해 연구를 진행하고 있으며, 별도로 15종의 발현변화 유전자를 확인하고 역시 그 의의에 관한 연구를 진행하고 있음.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목 차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 12
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 12
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 12
• Ⅲ. 연구성과 ... 13