초록 ▼

최근 한국 연안에서는 과거에 비해 독성해파리의 출현이 크게 증가하여 그에 따른 피해가 지속되고 있음. 반면에 이들 독성해파리에 대한 연구는 거의 전무한 실정이라 그에 대한 대처 또한 어려운 실정임. 해파리의 독소 연구는 말벌, 뱀과 달리 순수한 독액은 분리하는 것부터 어려움이 많음. 이를 개선하고자 자가융해(Autolysis)룰 이용해 순수한 자포(nematocyst)의 분리를 시행하였음. 먼저 증류수와 바닷물에서 자가융해를 실시하였을 때 자포세포가 안정하게 촉수에서 떨어져 나옴을 관찰하였음. 결과적으로 바닷물에서 더 안정한 자포세

최근 한국 연안에서는 과거에 비해 독성해파리의 출현이 크게 증가하여 그에 따른 피해가 지속되고 있음. 반면에 이들 독성해파리에 대한 연구는 거의 전무한 실정이라 그에 대한 대처 또한 어려운 실정임. 해파리의 독소 연구는 말벌, 뱀과 달리 순수한 독액은 분리하는 것부터 어려움이 많음. 이를 개선하고자 자가융해(Autolysis)룰 이용해 순수한 자포(nematocyst)의 분리를 시행하였음. 먼저 증류수와 바닷물에서 자가융해를 실시하였을 때 자포세포가 안정하게 촉수에서 떨어져 나옴을 관찰하였음. 결과적으로 바닷물에서 더 안정한 자포세포를 얻을 수 있었음. 이후 실험은 모두 바닷물에서 시행하였으며 순수한 자포세포를 많이 얻고자 노력하였음. 바닷물을 이용한 자가융해 처리 기간을 도출하기 위해 자가융해 기간 동안에 매일 촉수를 현미경 관찰을 통해 조직과 자포세포가 얼마나 분리되었는지 확인하였음. 노무라입깃해파리의 경우 3~5일정도 자가융해를 실시하여 촉수에서 분리된 자포세포를 얻을 수 있었고 라스톤입방해파라의 경우 7일정도 자가융해를 실시하여 자포세포를 얻을 수 있었음. 이후 순수한 자포세포를 얻고자 원심분리의 속도를 정하기 위해 자가융해 된 바닷물 상층액을 여러 조건의 원심분리를 통해 관찰하였음. 1차 원심분리는 1000g, 5분간 시행하여 자포세포를 모은 뒤 2, 3차 원심분리는 500g, 5분간 시행하여 조직과 자포세포를 분리하도록 노력하였음. 그리고 최종적으로 100g, 5분간 원심분리를 시행하여 순수한 자포세포를 얻음. 개선 된 자포세포의 정제법이 이전과 얼마나 차이가 나는지 확인하기 위해 단백량, 세포를 이용한 반수치 치사량, 용혈 독성 수치를 측정하였다. 단백량의 경우 이전 샘플에 비해 약 2~3배 가량 감소하였으나 세포의 반치사농도(LC₅₀)가 HaCat은 약 3배, H₉C₂는 약 6배 낮아 졌음. 또한 용혈 독성 수치는 60배 이상 낮았음. 이는 정제하는 과정에서 조직은 제거되고 자포세포의 수율이 높아져 상대적으로 독성의 수치가 낮아짐으로 인해 적은 양으로도 그에 상응한 독성을 나타냄을 알 수 있음. 결과적으로 더 높은 수율의 자포세포를 분리하여 이전과 동일한 무게에서 더 높은 독성이 나타남을 알 수 있음.
위의 실험으로 얻은 자포세포를 이용하여 독소 분리를 시도하였음. 해파리의 독액이 주로 단백독이며 그 중 metalloproteinase가 독성과 관련 있음을 1, 2차년도 연구를 통해 알았음. 이 사실을 바탕으로 FPLC를 이용하여 분리하였음. 먼저 Ion exchange인 DEAE column을 이용하여 분리하였음. 분리할 샘플을 막 투과법을 이용하여 소금제거 및 안정화를 시킨 뒤 DEAE column에 주입, 1M NaCl을 0~100%로 서서히 elution시켜 두 피크를 얻었음. 두 피크는 HaCat(human keratinocyte)을 이용해 세포 독성을 알아 봄. 또한 metalloproteinase임을 알아보기 위해 Gelatin Zymography을 통해 알아보았음. SDS-PAGE를 통해 전기영동 된 단백의 크기를 알아봄. 그 결과 피크 1에서 가장 높은 세포 독성이 나타났고 이는 Gelatin Zymography에서 100kDa 이상의 활성을 갖는 단백이 세포 독성을 나타냄을 알 수 있었음. 위 결과를 바탕으로 피크 1을 농축하여 Size exculsion인 Superdex 200 column을 이용하여 재분리를 시도하였고 그 결과 다섯 개의 피크를 얻음. 각 피크별로 위 실험과 동일한 조건으로 세포 독성, SDS-PAGE, Gelatin Zymography를 실시함. 다섯 개의 피크 중 피크 1과 2에서 가장 강한 세포 독성을 나타냄. 이를 Gelatin Zymography를 통해 효소활성을 본 결과 150kDa 이상인 단백의 metalloproteinase 활성이 강할수록 세포 독성이 강함을 알 수 있었음.
커튼원양해파리의 독액을 추출하여 황산암모늄 침출법을 시도하였음. 효소 활성을 갖는 독성 단백질만 얻기 위해 위의 침전법을 이용하였음. 최종 농도 40%의 ammonium sulfate를 추출한 독액과 5분간 섞은 뒤 얼음에 4시간 정치시킨 뒤 10000rpm 4℃ 15분간 원심분리한 뒤 얻은 pellet은 소량의 PBS(phosphate buffer saline pH 7.4)에 녹여 막 투과법을 이용해 염을 제거함. 하루 동안 투석한 뒤 10000rpm 4℃ 15분간 원심분리하여 아세톤으로 불순물을 제거함. 한번 더 동일한 조건으로 원심분리함. 각각의 과정을 Gelatin Zymography을 통해 활성을 측정하였음. 그 결과 SDS-PAGE 상에서 단백양의 차이가 있으나 Gelain Zymography에서 동일한 활성을 나타냄. 이를 통해 황산암모늄 침출법을 하여 얻은 샘플이 동일한 단백양에 비해 월등히 활성이 높음을 알 수 있음. 추출한 단백을 위의 침전법을 이용하여 분리할 시 더 높은 수율의 활성 단백만 얻을 수 있음을 예상함.
노무라입깃해파리의 독액이 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 H₉C₂(rat cardiomyoblast)에 독액을 처리하여 2-DE를 이용해 변화된 단백 성상을 확인해 봄. H₉C₂에 독액을 6시간, 12시간 처리한 뒤 TCA 침출법을 이용하여 농축, 2-DE에 주입하여 pH와 크기별 단백의 성상을 확인함. 이후 2-DE로 분리 된 단백을 MALDI-TOF를 이용하여 분석함.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 12
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 13
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 13
• Ⅲ. 연구성과 ... 14