초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
1. O, Asia1, A형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작
- O형 구제역 재조합 바이러스 클론 작성 : O1 Manisa, Cathay, O/KOR/AD/2010
- A형 구제역 재조합 바이러스 클론작성 : A/KOR/Pocheon/2010, A/Iran/05, A22Iraq
- Asia1 구제역 재조합 바이러스 클론작성 : Asia1/MOG, Asia1/LC04(Genogroup IV), Asia1/Sharmir
-상기 바이러스중 9종의 재조합 바이러스가 제

5. 최종 연구결과 요약
1. O, Asia1, A형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작
- O형 구제역 재조합 바이러스 클론 작성 : O1 Manisa, Cathay, O/KOR/AD/2010
- A형 구제역 재조합 바이러스 클론작성 : A/KOR/Pocheon/2010, A/Iran/05, A22Iraq
- Asia1 구제역 재조합 바이러스 클론작성 : Asia1/MOG, Asia1/LC04(Genogroup IV), Asia1/Sharmir
-상기 바이러스중 9종의 재조합 바이러스가 제작(recovery)되었음.
2. 구제역바이러스의 병원성 유전자의 제거를 위한 조작
- 일부 유전자가 결손이 되어도 증식에는 문제가 없는 3A와 3B 부위의 결손 조작
- 3D의 일부 유전자를 교체하여 apoptosis를 도모하여 병원성을 줄이기 위한 전략 수행되 었으나 유전자의 변이가 형성되어 다른 아미노산으로 변이가 형성되는 것을 확인
- 비병원성 바이러스인 소 리노바이러스(BRV type1)의 3D로 대체하여 구제역 바이러스가 병원성이 없도록 디자인된 클론을 제작하였으나 바이러스는 회복이 안됨
- 상기 비병원성 바이러스 또는 항원강화를 위한 유전자 조작을 위하여 8종의 재조합 바이러스를 추가로 제작함
- 3A의 경우 제거해도 바이러스의 역가의 차이는 크게 보이지 않았으나 3B2와 같이 제거 할 경우 바이러스가 많이 낮아 졌으며, O manisa와는 다르게 A-pocheon주에서는 3A를 제거한 경우 바이러스가 회복되지 않았음
3. 안전한 백신제작을 위한 백신 후보주의 병원성 시험
- O-cathay P1-3B2D는 돼지에서 병원성을 보이지 않았으나,
- O-SKR-2002-3B2D는 특이 임상증상과 병원성이 확인됨.
- 소 유래 바이러스 (O 형 manisa, 여러 아종포함 제작)를 유산양에서 바이러스의 병원성 및 공격접종을 실시한 결과 바이러스의 병원성은 확인되지 않았고 바이러스의 분리도 되지 않았고, 접종후의 체온의 변화도 보이지 않았음.
4. 구제역 재조합 백신의 동물에서의 면역원성 시험
- 시험제조된 백신을 마우스 및 돼지에서 면역원성 및 안전성 시험을 실시하여,
- 마우스에서 O-cathay-3B2d 및 O manisa의 경우 4주만에 항체 양성임이 확인되었고,
- 돼지에서는 cathay-P1-3B2d는 면역성이 좋아 접종 후 2차 접종 후 그 면역효과가 뛰어나게 상승되는 것을 확인
5. 구제역 재조합 백신의 동물에서의 안전성 시험
- 돼지에서 O-cathay-3B2d 및 O manisa를 이용한 백신 접종에서 임상증상 및 체온 변화가 관찰되지 않아 안전성 시험에 없음을 확인하였음

Abstract ▼

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly infectious viral disease affecting domestic cloven-hoofed cattle, pigs, sheep and goats. Conventional FMD vaccines can readily be produced from chemically inactivated tissue culture-propagated virus. As an alternative to the adaptation or attenuation process,

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly infectious viral disease affecting domestic cloven-hoofed cattle, pigs, sheep and goats. Conventional FMD vaccines can readily be produced from chemically inactivated tissue culture-propagated virus. As an alternative to the adaptation or attenuation process, the construction of cDNA for recovery of recombinant FMDV (rFMDV) is proposed. Specifically, it may be possible to replace the antigenic determinants of well-defined vaccine strain or target field strains in the full-length infectious clone. In the result, the rFMDV might be used as a strain of alternative vaccine candidate.
Full infectious clone of vaccine strain O1 Manisa, O/SKR/2002pig, A-Pocheon was produced by QIA. The viral RNA was extracted from supernatant of BHK21 which infected with cell adapted O, Asia1, A serotypes. The cDNA was synthesized using SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Sequence of P1 region of various serotypes was synthesized or amplified. The P1 region of O1 Manisa, O/SKR/2002pig, A-Pocheon full infectious clone was replaced with those of O, A, Asia1 serotypes using PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYME) and Long Ligation kit (TAKARA) respectively. Cloning result was confirmed by full sequencing and the resulted plasmids were designated as pO1m/AsMOGP1 and pO1m/AsVNLC04P1. The recombinant plasmids were linearized with SpeI and directly transfected into BHK/T7-9 cells that stably express T7 RNA polymerase using Lipofectamine2000 (Invitrogen). The transfectants were blind passaged in ZZ-R cells until cell CPE observed. We obtained the recombinant viruses as following ; O type viruses (O/AD/KOR/2010, O-Cathay, O manisa), Asia1 type viruses (As1/MOG/2005, As1/VN/LC04), A type viruses (A-Pocheon, A22 Iraq, A Iran05).
Furthermore, to get low pathogenic viruses, following strategy was implemented. The genome of FMDV differs from that of other picornaviruses in that it encodes a larger 3A protein, as well as three copies of protein 3B. The 3A protein has been implicated in host range and virulence. And protein 3B in covalently bound to the 5’end of the genome, and functions in priming picornavirus RNA synthesis. Although 3A and 3B proteins are related to viral pathogenicity, previous studies have shown that mutant viruses encoding partial deleted 3A or 3B region had growth characteristics similar to the parental virus in cells. Therefore, recovered FMD virus from deletion mutants of 3A or 3B coding-region may help to develop the advanced FMDV vaccines in future.
The results of this study showed that deletions of partial sequence of FMDV vaccine strain O1Manisa 3A or/and 3B do not drastically affect virus replication. RNA synthesis and protein cleavage processes were not significantly affected in these mutant viruses. It has been reported that nonstructural proteins such as 3A or 3B could be potentially used as serological markers in differentiation of vaccinated and natural infected animals. Thus, recombinant virus from deletion mutants of 3A or/and 3B clones may be used as an alternative marker vaccine.

목차 Contents

• 총괄 요약표 ... 1
• 연구과제 최종결과보고서 ... 3
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 재 료 ... 5
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• Ⅲ. 연구결과 ... 6
• 1. O형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작 ... 6
• 2. Asia1형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작 ... 7
• 3. A형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작 ... 7
• 4. 구제역바이러스의 병원성 유전자의 제거를 위한 조작 ... 8
• 5. cDNA clone으로부터 재조합 구제역바이러스의 회복 ... 9
• 6. 안전한 백신을 위한 백신후보주의 병원성 시험 ... 13
• 7. 구제역 재조합 백신의 동물에서의 면역원성 시험 ... 16
• 8. 구제역 재조합 백신의 목적동물(돼지)에서의 안전성 시험 ... 18
• 9. 제작된 구제역 재조합 바이러스의 특성 요약 ... 19
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 20
• 1. O, Asia1, A형 구제역바이러스의 방어유전자가 삽입된 바이러스 제작 ... 20
• 2. 구제역바이러스의 병원성 유전자의 제거를 위한 조작 ... 20
• 3. 안전한 백신제작을 위한 백신 후보주의 병원성 시험 ... 20
• 4. 구제역 재조합 백신의 동물에서의 면역원성 시험 ... 20
• 5. 구제역 재조합 백신의 동물에서의 안전성 시험 ... 21
• Ⅴ. 고 찰 ... 21
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 22
• Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 22
• Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 22
• IX. 참고자료 ... 22
• X. 영문초록 ... 24
• 끝페이지 ... 24