초록 ▼

○ 연구결과
(1) 당근의 최적의 DNA 추출 방법을 확립하기 위해 20% SDS, 1X CTAB, 2X CTAB 등의 방법을 이용한 실험을 통해 각각의 방법으로 추출된 DNA 순도와 농도를 확인하였다. 평균값을 비교한 결과 2X CTAB을 이용한 DNA 추출방법에서의 순도가 A260/A230 2.00의 평균값을 나타내어 최적의 방법으로 확인되었다.
(2) 무모계 종자 관련 분자마커 개발을 위해 1 차년도에 단모종자 표현형을 보이는 CT-SMR 616 line을 sib cross을 통해 이용하였고, 2 차년도부터 5차년도

○ 연구결과
(1) 당근의 최적의 DNA 추출 방법을 확립하기 위해 20% SDS, 1X CTAB, 2X CTAB 등의 방법을 이용한 실험을 통해 각각의 방법으로 추출된 DNA 순도와 농도를 확인하였다. 평균값을 비교한 결과 2X CTAB을 이용한 DNA 추출방법에서의 순도가 A260/A230 2.00의 평균값을 나타내어 최적의 방법으로 확인되었다.
(2) 무모계 종자 관련 분자마커 개발을 위해 1 차년도에 단모종자 표현형을 보이는 CT-SMR 616 line을 sib cross을 통해 이용하였고, 2 차년도부터 5차년도까지는 selfing을 통해 무모 종자 표현형을 보이는 계통을 육성하였다. 대조군으로는 CT-SMR 616 line에서 유모종자 표현형을 보이는 개체를 이용해 sib cross 후에 selfing을 통해 계통을 육성하였다.
(3) 당근의 종자 표현형을 측정한 결과 종자모 길이와 종자 면적의 값이 개체별로 차이가 있는 것을 확인하였다. 단모형 종자 표현형을 보이는 개체를 selfing 하여 고정함으로써 무모계 종자 분자마커 개발을 위해 이용하였다.
(4) 무모계 종자 관련 RAPD 분자마커 개발을 위해 CT-SMR 616 line의 무모형 개체군과 유모형 개체군을 이용하여 RAPD 실험을 통해 다형성을 확인하였다. 총 17개의 특이적인 RAPD 분자마커 중 무모형 종자 표현형을 보이는 계통에서 5개의 random primer에서 특이적인 다형성을 확인할 수 있었고, 유모형 종자 표현형을 보이는 계통에서 12개의 random primer에서 특이적인 다형성을 확인할 수 있었다.
(5) 단모형 종자 표현형 계통과 유모형 종자 표현형 계통을 이용하여 확인된 RAPD 다형성을 통해 NYSYSpc21 프로그램을 통해 UPGMA 법에 따라 dendrogram을 작성하였다. 그 결과 단모형 종자 표현형 계통과 유모형 종자 표현형 계통은 유전적 형질이 분명한 차이가 있는 것으로 확인되었다.
(6) 종자모 형질 특이적인 SCAR 분자마커 개발을 위해 RAPD 실험을 통해 확인된 OPA6, OPA18, OPAN 2 primer로부터의 종자모 형질 특이적인 band의 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열의 분석을 통해 SCA6₉₀₄과 SCA18₅₅₃, SCA2_1.2의 SCAR 분자마커 개발을 하였다. 개발된 3개의 SCAR marker 중, SCA6₉₀₄, SCA2_1.2는 단모종자 표현형을 보이는 계통에서만 특이적으로 증폭되어 다형성을 확인할 수 있었고, SCA18553는 유모종자 표현형을 보이는 계통에서만 특이적으로 증폭되어 다형성을 확인할 수 있었다.
(7) 당근 종자모 형질관련 연구에 있어 RNA 수준의 발현차이를 비교분석하기 위하여 cDNA library를 작성하였다. 단모형 종자 표현형 개체(CT-SMR 616 OP 659-1 및 CT-SMR 616 OP 677-14) 및 유모형 종자 표현형 개체 (CT-ATR 615 OP 666-13 및 CT-ATR 615 OP 671-9)를 이용하여 수정 후 자방이 부풀기 시작하는 시기에 종자를 채취하여 각각의 개체별 cDNA library를 작성하였다.
(8) 단모형 종자 표현형 개체 (CT-SMR 616 OP 659-1과 CT-SMR 616 OP 677-14) 및 유모형 종자 표현형 개체 (CT-ATR 615 OP 666-13과 CT-ATR 615 OP 671-9)를 이용해 작성된 cDNA library를 통한 개체별 1248개의 EST 염기서열을 확보하였다. EST 염기서열자료를 바탕으로 유모 및 단모 종자 개체의 Functional category별 비교 분석을 수행하였으며, GO data 비교분석을 통해 종자모 형질에 관여할 것으로 예상되는 14개의 EST를 선발하였다.
(9) GO data를 바탕으로 분석된 당근 종자모 형질에 관여할 것으로 예상되는 14개의 EST에 대하여 real-time PCR을 통해 검정하였다. 그 결과 extensin 유전자의 단모 및 유모 개체 간 유의적인 발현차이를 확인하였다.
(10) EST 염기서열 분석결과에서 확인된 SSR site를 이용하여 종자모 형질관련 SSR 분자마커 개발을 하였다. 263개의 SSR primer를 이용하여 다형성이 확인된 11개의 SSR 분자마커를 확인하였으며, 이들 마커 중 종자모 형질 특이적인 394-12-B05 SSR 마커를 개발하였으며, 후대검정을 통해 종자모 형질 관련 특이적 분자마커임을 확인할 수 있었다.
(11) EST 염기서열 분석결과에서 단모종자 표현형 개체와 유모종자 표현형 개체의 36개의 single nucleotide polymorphism site를 확보하였고, 이를 이용해 HRM 분석을 하여 659-677-6 SNP 분자마커를 개발하였다. HRM 결과로 확인된 659-677-6 SNP site를 이용해 AS-PCR을 한 결과 유모종자와 무모종자의 형질이 뚜렷하게 확인되었다. 후대검정을 통해 정확성을 확인한 결과 종자모 형질 관련 선발에 충분히 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
(12) 당근 종자모 형질관련 분자마커를 이용하여 linkage map을 작성하였다. 총 194.6cM의linkage map이 작성되었으며, 당근 염색체 수와 동일한 9개의 연관그룹으로 분포되어 있음을 확인하였다.
(13) 무모계 수출용 당근 육성을 위해 해외 유전자원을 도입하여 특성평가 후 육성소재로 활용하고자 하였다. 해외 유전자원 중 근색이 Red-type인 계통이 육성소재로 이용가치가 큰 것 으로 생각되어 품종 개발의 재료로 사용하여 육성하였다.
(14) 2006년부터 2013년까지 모본 성능검정을 통해 CT-SMR OP-616 OP-389-1-3 line에서 파생된 계통과 616 OP-389-⊗-14-line에서 단모로 표현되는 계통, 대조구 line, 웅성불임 line의 모본의 개체별 특성을 파악하여 선발개체는 계통육성에 활용하였고, 특성조사결과 형질이 고정됨을 확인하였다.
(15) 화분친 계통은 중국유래 계통 Nantes-type과 인도유래 계통 Deci-Red type 계통을 공시하여 근색, 심부색, 근형 등의 특성을 고려하여 특성을 조사하였으며, 조합선발 중 Nantes-type과 Imperator-type을 제주월동시험에 공시하여 순도선발을 하였다.
(16) 무모종자와 유모종자의 표현형을 비교분석한 결과, 유모종자는 화뢰형성부터 자방의 표면에 육안으로 확인이 가능할 정도의 모용이 붙어있었으며, 수정 후 꽃잎이 떨어지고 3∼4일경부터 모용의 신장으로 수정여부를 확인할 수 있었다. 이에 반해, 무모종자는 화뢰형성부터 자방의 표현에 모용이 없거나 짧고, 정상적인 수정이 완료된 후에도 과피에 붙어있는 모용이 퇴화되거나 신장되지 않고 과피, 종피, 배유만 정상적으로 발육됨을 확인하였다.
(17) 2009년부터 2013년 동안 당근 품종육성에 필요한 계통 구성을 위해 무모와 MS-line, 화분친 계통을 육성하였고, 각 계통별로 특성조사를 한 결과, 형질이 고정됨을 확인하였다. 이 계통을 이용하여 수출용 무모계 당근 품종육성에 이용하였다.
(18) 2012년부터 2013년까지 우량계통, 선발, 분리, 세대 진전으로 고정된 80조합의 F₁을 작성하고, 성능 평가 후 특성별 조합을 선발하였다. 선발된 조합은 제주 및 중국월동재배의 재료로 활용하였으며, 육성목표에 부합되는 교잡을 통해 4개의 조합을 선발하였다.
(19) 저온기 재배에 적합하고, 근색이 빨간색인 육종목표에 부합되는 F₁조합의 지역적응성 시험을 통해 현지(제주, 중국) 기후 및 환경 적응성을 갖춘 우수조합선발을 하였다. 2012년과 2013년에 제주도 연락시험과 중국연락시험을 통해 선발조합 중 No. 6346, 6375가 근피색의 착색이 우수하고, 근장이 길며 균일한 우수조합으로 평가되었다.
(20) 제주도와 중국의 3개 지역에서 지역적응성 시험을 실시하였으며, Nantes-type의 No. 6346이 최종선발조합으로 확인되었다. No. 6346은 근비대가 빠르고, 근피가 매끈하여 상품성이 높은 우수조합으로 확인되었으며, “레드스타(Red-star)” 당근으로 명명하여 품종보호출원을 신청하였다.

Abstract ▼

Ⅲ. RESULTS
The results obtained in this study are summarized as follows.
(1) The optimal gDNA extraction method from carrots was investigated using 20% SDS, 1× CTAB, and 2× CTAB extraction methods, and the purity and concentration of the extracted DNA were confirmed. A comparison of the mean

Ⅲ. RESULTS
The results obtained in this study are summarized as follows.
(1) The optimal gDNA extraction method from carrots was investigated using 20% SDS, 1× CTAB, and 2× CTAB extraction methods, and the purity and concentration of the extracted DNA were confirmed. A comparison of the mean purity values of the 2× CTAB gDNA extraction method indicated that an A260/A230 value of 2.00 was optimal.
(2) To develop molecular markers related to hairless seed characteristics, CT-SMR 616 lines that showed short-hair seed phenotype were used by sibling crosses in the first year. For 2 to 5 years hairless seed phenotype lines were bred through selfing. As control line, the individual with hairy seed phenotype selected from CT-SMR 616 line was used through sib cross and selfing.
(3) Analysis of the carrot seed phenotypes indicated a difference between individuals in mean seed-hair length and seed area. Molecular markers related to hairless seed characteristics were developed through fixation of the hairless seed characteristics (short-hair seed phenotype) by selected individual selfing.
(4) To develop RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers related to hairless seed characteristics, the CT-SMR 616 and CT-SMR 389 line were selected as short-hair seed phenotype and the hairy-seed phenotype lines, respectively. Among 17 specific RAPD markers, short-hair seed phenotypes were observed to be polymorphic using 5 random primers and hairy-seed phenotypes were observed to be polymorphic using 12 random primers.
(5) Values of genetic separation between short-hair and hairy-seed phenotype lines were obtained and visualized in a dendrogram using the UPGMA method in the program NTSYSpc 2.1. As a result, genetic characteristics of short-hair and hairy-seed phenotype lines were clearly separated.
(6) To develop SCAR marker specific for seed-hair characteristics, sequencing analysis was completed for specific OPA6, OPA18, and OPAN2 RAPD markers related to seed-hair characteristics, and SCA6₉₀₄,SCA18₅₅₃, and SCA21.2 SCAR markers were developed through sequence analysis. Among these three SCAR markers, the two SCAR markers SCA6₉₀₄, and SCA2_1.2 were developed to specify the short-hair seed line, and SCA18₅₅₃ was developed to discriminate the hairy-seed line.
(7) To study the RNA expression levels related to seed-hair characteristics, cDNA libraries were constructed using the short-hair and hairy-seed phenotype lines. We constructed cDNA libraries at the onset of ovary expansion, using the CT-SMR 616 OP 659-1 and CT-SMR 616 OP 677-14 lines for the short-hair seed phenotype and the CT-ATR 615 OP 666-13 and CT-ATR 615 OP 671-9 lines for the hairy-seed phenotype.
(8) In total, 1248 EST (Expressed Sequence Tag) sequences were obtained by constructing cDNA libraries using the CT-SMR 616 OP 659-1 and CT-SMR 616 OP 677-14 lines (short-hair seed phenotype) and the CT-ATR 615 OP 666-13 and CT-ATR 615 OP 671-9 lines (hairy-seed phenotype). On the basis of the EST sequence data, functional categories of short-hair and hairy-seed phenotype lines were established. And 14 ESTs related to seed-hair characteristics were selected through Gene ontology (GO) data analysis.
(9) Fourteen EST sequences of the GO data analyzed on the basis of seed-hair characteristics was analyzed by quantitative real-time RT PCR. As a result, extensin gene was significantly differentially expressed between short-hair and hairy-seed phenotypes.
(10) Simple sequence repeat (SSR) sites identified in the EST sequence analysis were used to develop SSR molecular markers related to seed-hair characteristics. We selected 11 EST-SSR markers showed polymorphism using 263 EST-SSR primer pairs. Among these, the 394-12-B05 SSR marker was developed, and its accuracy was evaluated through a progeny test.
(11) The EST sequence analysis results confirmed 36 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sites from short-hair and hairy-seed phenotype lines, and the 659-677-6 SNP marker was developed for high resolution melting (HRM) analysis using 36 SNPs. Allele-specific PCR (AS-PCR) results using the 659-677-6 SNP site can be used to clearly divide short-hair and hairy-seed phenotype lines. Accuracy was confirmed through a progeny test, and selection related to seed-hair characteristics can be considered to be fully utilized.
(12) Linkage map were constructed using molecular markers associated with seed-hair characteristics. 194.6 cM length of linkage map has been constructed and distributed in the 9 linkage groups as the same chromosome numbers of carrot.
(13) Following the tests for morphological characteristics, the genetic materials introduced from foreign countries was used in the development of hairless-seed varieties. Because of the red root type carrot among the foreign genetic materials has high potential of usefulness as cultivar materials for export, this type of variety was determined as development materials.
(14) Through a pedigree test from 2006 to 2013, morphological characteristics of the selected individual lines derived from the CT-SMR OP-616 OP-389-1-3 line and the short-hair phenotype derived from the 616 OP-389-⊗-14-line, control line, and male sterile line were tested, utilized in breeding program, and finally identified the fixed characteristics.
(15) The morphological characteristics (e.g. root color, core color, root type) of pollen parent lines were tested using Nantes-type lines derived from China and Deci-type lines derived from India, and purity tests of selected Nantes- and Imperator-types out of the different combination lines conducted in Jeju Island in winter.
(16) Comparative analysis of phenotype differences between hairless and hairy seeds indicated that seed hairs on the surface of the ovary could be observed with the unaided eye from the time of flower bud formation in hairy seeds. The pollination condition was confirmed by elongation of seed hairs from 3 to 4 d after of the petals were shed, followed by pollination. However, seed hairs on the surface of the ovary did not exist or were short in hairless-seed individuals. Normal development of pericarp, testa, and endosperm were confirmed after normal pollination was completed without atrophy or elongation of seed hairs.
(17) Through 2009 to 2013, hairless, MS, and pollen parent lines were cultivated to select combinations needed to develop carrot varieties. Morphological characteristic testing of each combination confirmed the fixed characteristics. Selected combinations were used for the development of hairless carrot cultivars for export.
(18) We produced 80 fixed F1 combinations through the process of superior combination selection, separation, and progeny development from 2012 to 2013. On the basis of their characteristics, certain combinations were selected after performance evaluation. Selected combinations were used as materials for winter cultivation on Jeju Island and in China. Four combinations suited to achieve the breeding goals were selected through crossing.
(19) Superior combinations exhibiting local (Jeju Island, China) climate and environmental adaptability were selected through a local adaptability test of F1 combinations, with tolerance to low temperatures and red roots as the breeding goals. Among the selected combinations, Nos. 6346 and 6375, which have excellent rhizodermal coloring and longer roots, were considered superior combinations based on local tests conducted on Jeju Island and in China in 2012 and 2013.
(20) Local adaptability tests were conducted on Jeju Island and in three regions of China. As a result, the Nantes-type No. 6346 combination was ultimately selected as the most suitable combination. No. 6346 has characteristics of fast root growth and a smooth rhizodermis, which should result in high marketability. We applied for Plant Variety Protection for No. 6346 under the name “Red-star.”

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• CONTENT ... 12
• 목 차 ... 13
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 제1절 연구개발의 목적 ... 14
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 14
• 제3절 연구개발 내용 및 범위 ... 16
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 제1절 본 연구관련 국내외 기술수준 비교 ... 19
• 제2절 특허분석에 따른 본 연구과제와의 관련성 ... 20
• 제3절 논문분석에 따른 본 연구과제와의 관련성 ... 20
• 제4절 제품 및 시장 분석 ... 21
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 34
• 제1세부과제 – 무모계 종자 관련 분자마커 개발 ... 34
• 제1절 당근 무모계 종자 관련 연구 및 개발을 위한 DNA 추출 방법 확립 ... 34
• 제2절 당근 무모계 종자 관련 연구 및 분자마커 개발을 위한 당근 재료 확보 ... 39
• 제3절 당근 무모계 종자 관련 RAPD 및 SCAR 분자마커 개발 및 분석 ... 108
• 제4절 당근 무모계 종자 관련 AFLP 분자마커 개발 및 분석 ... 182
• 제5절 EST profiling을 위한 당근 종자 cDNA library 작성 및 EST 염기서열 분석 ... 194
• 제6절 당근 종자모 형질 관련 EST profiling ... 214
• 제7절 EST sequence를 이용한 SNP 및 SSR site 탐색 ... 259
• 제8절 당근 종자모 형질 관련 SSR 분자마커 개발 및 분석 ... 296
• 제9절 당근 종자모 형질 관련 SNP 분자마커 개발 및 분석 ... 305
• 제10절 EST sequence를 바탕으로 당근 종자모 형질 관련 후보 유전자 탐색 및 분석 ... 320
• 제11절 당근 종자모 형질 관련 분자마커를 이용한 linkage map 작성 및 분석 ... 326
• 제1협동과제 – 무모계 당근 종자 품종 육성 ... 332
• 제1절 유전자원 도입 및 특성파악 ... 332
• 제2절 모본성능검정 및 선발 ... 347
• 제3절 계통육성 및 교배 ... 451
• 제4절 F1 조합작성 및 성능검정 ... 604
• 제5절 F1 지역적응성 시험 ... 616
• 제6절 품종보호출원 ... 625
• 제7절 채종시험 및 원원종 증식 ... 627
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 628
• 제1절 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 628
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 630
• 제1절 연구개발 성과 ... 630
• 제2절 성과활용 계획 ... 635
• 제6장 참고문헌 ... 636
• 끝페이지 ... 646