보고서 정보
주관연구기관 |
경상대학교 GyeongSang National University |
연구책임자 |
정덕화
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참여연구자 |
김형갑
,
송재영
,
강진순
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1998-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018414 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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초록
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○ 연구결과
1) 단크론성 항체를 개발하기 위해 우선 bromacil과 bentazon으로부터 단백질과 결합할 수 있는 coupling site를 가진 hapten으로 전이 시켜 각각 3-5-bromo-3-1-methylpropyl-2-4C1H,3H)
-pyrimidinedione-5-yl-propanoic acid 와 3-ìsopropyl-l -methyl-2,1,3-benzothiadiazin -4(3H) -one-2,2
-dioxide를 합성하고 이들을 keyhole limpet hemocyanin( KLH)과
○ 연구결과
1) 단크론성 항체를 개발하기 위해 우선 bromacil과 bentazon으로부터 단백질과 결합할 수 있는 coupling site를 가진 hapten으로 전이 시켜 각각 3-5-bromo-3-1-methylpropyl-2-4C1H,3H)
-pyrimidinedione-5-yl-propanoic acid 와 3-ìsopropyl-l -methyl-2,1,3-benzothiadiazin -4(3H) -one-2,2
-dioxide를 합성하고 이들을 keyhole limpet hemocyanin( KLH)과 결합시켜 항원으로 사용하였고 bovine s않um a1buffiÌnCBSA) 또는 ova1bumine(OVA)과 결합시켜 coating conjugate로 사용하였다.
2) 형질세포종세포(p3 x 63Ag8.v653)와 bromacil-hapten-KLH 또는 bentazon-hapten-KLH를 면역시킨 암컷 BALB/c 마우스의 비장세포를 융합시켜 cloning 한 결과 bromacil과 bentazon에 대한 단크론성 항체를 생산하는 hybridoma 세포주를 각각 4세포주와 3세포주를 확보하였다.
3) Bromacil과 bentazon에 대한 특이한 단크론성 항체를 생성하는 hybridoma세포주를 mouse복강에 주입하여 얻은 복수의 항체 역가를 조사한 결과 bromacil은 1: 1,000,000에서도 역가를 보인 반면 bentazon는 1: 100,000의 역가를 나타내었다.
4) 생성된 bromacil에 대한 단크론성 항체는 bromacil에 매우 특이성을 보여 terbacil과 2%의 교차반응을 보였을 뿐 atrazine, 2,4-D, paraquat, bentazon, methoprene과는 교차반응을 나타내지 않았다. 이항체를 이용하여 bromacil을 측정하기 위해 indirect competitive ELISA법을 확립하였고 0.1-100 ppb수준의 bromacil분석이 가능하게 되었다. 아울러 bentazon에 대한 단크론성 항체도 bentazon에만 특이성을 보여 bramacil, terbacil, 2,4-D, paraquat, atrazine, methoprene 등과는 전혀 교차반응을 보이지 않았다. 이 항체를 이용하여 bentazon분석을 위해 indirect competitive ELISA법을 확립한 결과 lppb수준의 bentazon의 분석이 가능하였다.
5) Immunoaffinity column을 실험적으로 조제하여 식품 시료 중의 bromacil이나 bentazon을 정제하기 위한 조건을 확립하였다. Column은 먼저 10㎖, PBS로 씻고난 뒤 시료용액을 충진했으며 10㎖의 증류수와 lO㎖의 PBS로 다시 column을 씻은 후 3㎖의 methanol로 처리시키면 대부분 column에 결합되어 있는 bromacil과 bentazon이 대부분 용출되었다. Immunoaffinity column으로 전처리 한 시료를 ELISA 및 HPLC법으로 측정하여 회수율을 구한 결과 bromacil의 경우 음용수에서는 각각 88%, 94%를 보였고 토양에서는 각각 76%, 69%를 보였다. 반면에 bentazone의 경우에는 각각 83%, 86%를 나타내어 bomacil경우보다 낮은 회수율을 보였다.
상기의 bromacil 과 bentazon에 대한 특이한 단크론성 항체를 이용한 ELISA조건을 더욱 개선할 경우 ELISA법으로 식품속에 오염가능성이 있는 bromacil과 bentazon의 신속분석이 가능하게 될것으로 생각한다.
Abstract
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III. Results of the study
1. For the production of monoclonal antibody, bromacil and bentazon should be first converted to hapten which had a coupling site to combine with protein and 3-5-bromo-3-1-methylpropyl-2-4 pyrirnidinedione-6-yl -propanoic acid and 3-isopropyl-1-methyl-2,l,3 -benzonthiad
III. Results of the study
1. For the production of monoclonal antibody, bromacil and bentazon should be first converted to hapten which had a coupling site to combine with protein and 3-5-bromo-3-1-methylpropyl-2-4 pyrirnidinedione-6-yl -propanoic acid and 3-isopropyl-1-methyl-2,l,3 -benzonthiadiazin -4(3H)-one-2,2-dioxide were synthesized. They were conjugated to keyhole limpet hemocyanin(KLH) for use as immunogen and to bovine selllm albumin(BSA) or ovalbimin(OVA) for only use as coating conjugate.
2. hybridoma cell lines which could produce monoclonal antibodies against bromacil and bentazon were developed by fusing myeloma cells(P3x63Ag8.V653) with spleen cells of BALB/c female mice immunized with bromacil hapten-KLH conjugate and bentazon hapten-KLH conjugate. 4 hybridomas for the production of antibody to bromacil 3 hybridomas to bentazon were developed after cloning for long time.
3. The myeloma cell line produced monoclonal antibody specific for bromacil and bentazon was grown in tissue culture and as an ascites tumour. Antibody titers of above ascite fluid were shown 1: 1,000,000 on bromacil and 1: 100,000 more on bentazone, respectively.
4. Produced monoclonal antibody against bromacil was shown a very specificity to bromacil and only 2% cross reactivity with terbacil but did not with atrazine, 2,4-D, paraquat, bentazon and methoprene. -For analysis of bromacil, indirect competitive ELISA was established with that monoclonal antibody, and detection of O.l-lOOppb level of bromacil could be possible. Meanwhile produced monoclonal antibody against bentazon was also shown a very specificity to bentazon but did not with bromacil, terbacil, atrazine, 2,4-D, paraquat and methoprene. For analysis of bentazonl, indirect competitive ELISA was also established with that monoclonal antibody, and detection of 1 ppb level of bentazon could be possible. However, it took one day more to do whole ELISA procedure for the analysis of bromacil and bentazon.
5. Iimmunoaffinity column was experimentally made with coupling of antibody to affii-gel 10, and condition of sample purification of bromacil and bentazon in food including soil and drinking water was set up. Column was initially washed with lOme PBS and loaded sample solution, ans washed column lOme distilled water and 10m! PBS, and then bromacil and bentazon bound to antibody could be eluted only with 3m.e methanoL Recovery ratio of sample pretreated by immunoaffinity column was studied with ELISA and HPLC method. The recovery ratio of bromacil was 88%(ELISA) and 94%(HPLC) in drinking water but 76% and 69% in soil sample, respectively. The recovery ratio of bentazon was 83% and 86% , and was showed a low level than bromacil. If we more improve the ELISA condition with above monoclonal antibodies against bromacil and bentazon, rapid and sensitive analysis of bromacil and bentazon contaminated in foods could be possible as a trace level.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 요약문 ... 4
- SUMMARY ... 8
- CONTENTS ... 11
- 목차 ... 13
- 제1장 서론 ... 15
- 제2장 국내.외 기술개발 현황 ... 17
- 제3장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 19
- I. 실험재료 및 방법 ... 19
- II. 결과 및 고찰 ... 35
- III. 결론 ... 70
- 제4장 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도 ... 72
- 1. 연구개발목표의 달성도 ... 72
- 제5장 연구개발 결과의 활용계획 ... 73
- 제6장 참고문헌 ... 74
- 연구개발 최종보고서 ... 84
- 최종보고서 요약 (초록) ... 85
- 끝페이지 ... 86
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