보고서 정보
주관연구기관 |
국립수산과학원 National Fisheries Research and Development Institute |
연구책임자 |
강덕영
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참여연구자 |
조기채
,
김이운
,
김종화
,
강희웅
,
박광재
,
전제천
,
김규희
,
김효찬
,
명정인
,
이정호
,
노재구
,
김현철
,
이준
,
김경길
,
김종현
,
박영제
,
송홍인
,
김성연
,
손상규
,
김영섭
,
장영진
,
정민환
,
김영수
,
강한승
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2009-12 |
과제시작연도 |
2008 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
과제관리전문기관 |
한국해양수산기술진흥원 |
등록번호 |
TRKO201400022524 |
과제고유번호 |
1545000458 |
사업명 |
수산연구개발사업 |
DB 구축일자 |
2019-11-16
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초록
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Ⅳ. 연구개발 결과
1. 양식산 넙치의 유안측 백색증 발현에 미치는 환경인자들의 영향
본 연구에서는 광도(130~12,300 lux), 광주기(12L/12D or 24L/0D), 수조 재질(콘크리트 또는 FRP), 수조 색상(흰색 또는 국방색) 및 먹이생물 영양 강화의 효과를 포함하는 환경 영양적 인자들과 관련하여 넙치의 유안측 백색증의 원인을 조사하였다. 또한 12L/12D과 24L/0D. 아래에서 사육된 정상과 백색증 치어의 성장을 비교하였다. 더불어 백색증 치어를 2년간 사육 후 유안측의 표피색소 형태가 정상으로 돌
Ⅳ. 연구개발 결과
1. 양식산 넙치의 유안측 백색증 발현에 미치는 환경인자들의 영향
본 연구에서는 광도(130~12,300 lux), 광주기(12L/12D or 24L/0D), 수조 재질(콘크리트 또는 FRP), 수조 색상(흰색 또는 국방색) 및 먹이생물 영양 강화의 효과를 포함하는 환경 영양적 인자들과 관련하여 넙치의 유안측 백색증의 원인을 조사하였다. 또한 12L/12D과 24L/0D. 아래에서 사육된 정상과 백색증 치어의 성장을 비교하였다. 더불어 백색증 치어를 2년간 사육 후 유안측의 표피색소 형태가 정상으로 돌아오는지의 여부도 조사하였다. 그 결과 광주기, 수조 재질 및 색상이 넙치의 유안측 백색증 유도에 영향을 다소 미치는 것으로 확인되었지만, 주 요인은 아닌 것으로 관찰되었다. 대신 먹이생물의 선택과 공급이 종묘생산 단계에서 넙치의 유안측 백색증 발생을 극단적으로 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 정상과 백색증 개체 사이의 성장 비교 결과 24L/0D에서는 차이가 없었지만, 12L/12D에서는 백색증 개체들의 성장이 느린 것으로 확인되었다. 마지막으로 백색증 치어를 2년간 사육 후 유안측 표피색소 형태가 정상으로 돌아오는지의 여부를 알아본 결과, 유안측 전체에 착색은 이루어지나, 부분적으로 흑색소포의 침착이 부족한 상태로 백색증의 흔적은 잔존하는 것으로 확인되었다.
2. 양식산 넙치의 성장단계별 무안측 흑화의 발현 양상
본 연구에서 양식산 넙치의 종묘생산 과정 중 무안측에 일어나는 색소포 이상발현현상을 이해하기 위해 성장 단계별로 진행과정을 발생학적으로 조사하였다. 본 실험에서는 착저 직전 자어(전장 12.4±0.2 mm, 체중 19.9±0.7 mg, 부화 후 24일째)를 대상으로 실험을 개시하였다. 실험 기간은 부화 후 28일부터 부화 후 94일(전장 72.0±0.6 mm, 체중 3,912.3±119.4 mg)까지 실시하였다. 실험기간 중 사육 수온은 20±0.5℃로 일정하게 유지시켜 주었으며, 사육 염분은 30.9±0.1 psu를 유지하였다. 먹이는 성장 단계별로 로티퍼, 알테미아, 배합사료를 혼합 공급하였다. 그 결과 현미경학적으로 넙치의 최초의 착색현상 증세를 확인할 수 있는 것은, 부화 후 38일임을 알 수 있었다. 그러나 실제 육안으로 착색현상 발현이 관찰되는 최초 시기는 부화 후 52일째였다. 체색 반문의 수는 부화 후 31일부터 80일까지 급격히 증가하는 추세를 보였으며, 흑반문의 면적률은 66일부터 94일 사이 급격히 증가하는 경향을 보였다. 그리고 군집 내 무안측 착색개체 발생 비율은 45일부터 73일 사이에서 급격히 증가하였고, 이후 94일까지는 90% 정도에서 정체상을 나타내는 것으로 나타났다. 결론적으로 넙치 무안측 착색현상은 소형의 체색반점들이 무안측에서 군집화되면서, 하나 또는 여럿의 다양한 체색무늬(체색반문)가 무안측을 점령해 나가는 현상으로 이해할 수 있었다.
3. 양식산 흑화 넙치의 생리학적 특성
본 연구는 넙치를 인공사육 시설에서 사육 관리할 때 나타나는 무안측 흑화 증세의 스트레스 관련성을 확인하기 위해, 인공사육시설에서 생산된 넙치 양성어 중 무안측에 체색이 없는 것(정상 그룹)과 체색이 있는 것(흑화 그룹)들 사이의 스트레스 인자 비교 실험을 실시하였다. 본 실험에 사용된 실험어는 평균 전장 21.5±0.42 cm, 평균 무게 87.5±6.1 g였으며, 실험어의 무안측 착색 면적률은 정상 그룹 0.63±0.12%, 흑화그룹 16.7±4.7%였다. 분석한 스트레스 관련 인자는 혈중 GLU, TP, 코티졸 및 갑상선 호르몬(FT3 and FT4) 농도 및 어체 성분(수분, 조단백, 조지방, 조회분)이었다. 실험결과, 정상과 무안측 착색 넙치에 있어 혈중 GLU 및 TP의 농도는 정상 형질이 흑화형질보다 유의하게 높게 나타났다. 혈중 호르몬 농도에 있어 갑상선호르몬의 경우 정상과 흑화 그룹 사이에는 유의차를 찾아볼 수 없지만, 코티졸은 흑화 그룹이 정상 그룹에 비해 유의하게 높게 나타났다. 어체 중 영양 성분의 경우, 수분과 회분은 그룹간 유의차가 없었지만, 조단백은 흑화 그룹이 정상보다 다소 낮으며, 조지방은 정상보다 유의하게 높았다. 이상의 스트레스 인자를 통한 정상과 흑화 그룹 간 비교를 통해 알 수 있듯, 양식산 넙치의 흑화는 만성적인 약한 스트레스와 관련되어 있을 가능성이 높은 것으로 확인되었다.
4. 넙치의 무안측 흑화 발현에 있어 분자내분비적 관련성
4-1. MCH 관련성
넙치의 무안측 흑화에 있어 MCH 관련성을 조사하기 위해, prepro-MCH cDNA 염기서열을 구명하고, 정상과 흑화 개체 사이 mRNA 발현 차이를 비교하였다. 뇌로부터 prepro-MCH을 encoding한 cDNA를 복제하여 염기서열을 파악하였다. 넙치의 prepro-MCH cDNA는 590 bp 정도의 크기로, 24개의 신호성 단백질을 포함하는 135개 아미노산으로 구성되어 있었으며, 그중 MCH는 51 bp에 의해 지정되는 17개의 아미노산으로 구성된 단백질로 되어 있었다. RT-PCR을 통해 prepro-MCH mRNA 발현은 뇌와 여타 조직에서 관찰할 수 있었다. 또한 prepro-MCH mRNA 발현도는 무안측 흑화 개체들 보다는 정상개체가 높게 나타났다. 이상의 결과를 통해 MCH는 넙치의 무안측 흑화에 관련되어 있을 가능성이 있음을 알 수 있었다.
4-2. POMC 관련성
넙치의 무안측 흑화 발현에 있어 POMCs의 관련성을 조사하기 위해, 정상과 무안측 흑화 개체 사이에 3가지 POMC의 mRNA 발현량 차이를 Real-Time PCR를 이용해 조사하였다. 넙치 POMC-Ⅰ 및 Ⅱ의 cDNA 염기서열 정보는 NCBI에서 활용하였고, POMC-Ⅲ의 경우는 본 연구팀에서 직접 구명하여 실험에 활용하였다. 또한 POMC 유전자의 발현 부위를 알아보기 위해 뇌, 뇌하수체, 간, 신장, 아가미, 표피, 근육, 위, 내장 및 혈구들에서 조직 분포 실험을 실시하였다. 그 결과 본 연구에서는 692 bp의 open reading frame (ORF)을 포함하고 231개의 아미노산 잔기를 암호화하는 넙치의 POMC-Ⅲ(ofPOMC-Ⅲ)의 염기 서열을 해독했다. 또한 각 장기 조직별로 넙치의 POMC 유전자 발현 부위를 조사한 결과, POMC-Ⅰ의 경우는 뇌하수체에서만 조직특이적으로 발현되는데 비해, POMC- Ⅱ와 Ⅲ의 경우는 뇌와 뇌하수체를 포함한 조사된 모든 조직에서 발현되고 있음이 확인되었다. 한편 착색 개체와 비착색 개체 사이 유전자 활성도의 경우 넙치 POMC-Ⅰ 및 Ⅱ는 무안측 착색 개체들에서 높게 나타났으나, 정상개체에서는 유의하게 나타났다. 그에 반해 POMC-Ⅲ의 경우에는 특별한 차이가 없었다. 따라서 넙치의 무안측 흑화에는 POMC-Ⅰ와 Ⅱ가 관련되어 있을 가능성이 높은 반면, POMC-Ⅲ의 경우 가능성이 낮아 보인다.
5. 유전육종학적 관련성
5-1. 가계군집 간 관련성
넙치의 경우 여러 종류의 경제적으로 중요한 양적형질이 있지만, 최근 양식이 광범위하게 이루어지면서 환경적 요인에 영향을 많이 받는 백화나 흑화와 같은 체색이상이 중요 경제형질로 대두되고 있다. 본 연구에서는 넙치 사육 시 환경적 요인을 최소화하여 체색이상에 영향을 주는 유전적 요인을 조사함으로써 경제적으로 중요한 양적형질의 하나인 흑화를 극복할 수 있는 우량종묘생산에 대한 가능성을 검토하고자 하였다. 이를 위해 먼저 가계이력을 아는 어미 집단 498마리를 대상으로 흑화정도를 조사하고 가계별 흑화정도를 분석하였다. 이를 기초로 흑화가 높은 빈도로 발생하는 가계와 낮은 빈도로 발생하는 가계를 선정한 후 두 가계로부터 후대를 생산하고 후대의 흑화 정도를 측정하였다. 그 결과 두 가계 사이 흑화정도의 차이가 발생하였으며, 이는 넙치에서 발생하는 흑화에도 유전적 연관성이 존재한다는 것을 나타내며, 또한 선발육종을 통해 개량이 가능하다는 것을 시사한다.
5-2. 유전적 표현 인자
본 연구에서 확보한 넙치 단일염기 다형성(SNP)은 향후 유전적 향상을 목적으로는 선발육종에 유용한 유전자 표지로 사용될 것으로 예상된다. 본 연구에서는 앞서 어미 집단의 교배로부터 생산된 177가계의 2세대 넙치를 대상으로 넙치 흑화에 대한 유전모수를 추정하였다. 총 2,334마리의 넙치에 전자칩을 삽입하고 각 개체의 흑화정도를 기록 후 친자확인을 통하여 가계 분석을 실시한 결과 부화 후 87일령 넙치 흑화에 대한 유전력은 0.11로 추정되었다. 또한 전장과 흑화의 표현형 상관 및 유전상관은 각각 0.02, 0.09로 나타났다. 따라서 넙치 흑화에 대한 유전적 변이는 존재하며, 육종을 통한 유전적 개량이 가능할 것으로 보인다. 또한 두 종류의 넙치 유전자에 존재하는 단일염기 이형성을 탐색하고 이들 유전자와 형질간의 연관성을 조사하였다. 총 2,500마리의 F2 넙치를 대상으로 유전자표지를 이용하여 각 개체의 친자확인을 실시하였으며, 이를 토대로 각 가계간의 형질연관성을 분석하였다. 또한 TaqMan SNP genotyping assay 방법을 이용하여 skin color-regulating gene (melanin concentrating hormone, MCH)과 hypoxia-related gene (hypoxia induced gene 1)에 존재하는 단일염기 이형성에 대한 각 개체의 유전자형을 결정함으로써 이들 유전자 이형성과 형질간의 상호 연관성을 분석하였다. 그 결과 발굴된 각각의 단일염기 다형성이 넙치 흑화와 각 가계간의 연관성 분석에 유용한 유전자 지표로 이용될 수 있는 것으로 확인되었다.
6. 무안측 흑화 발현에 있어 서식 환경의 영향
6-1. 사육 밀도의 영향
본 연구는 넙치의 무안측 착색증 발현에 있어 사육 밀도의 영향을 알아보기 위해 전장 6.6±0.1 cm, 체중 2.55±0.04 g의 넙치 치어(부화 후 75일) 중 무안측면에 흑색 반점이 없는 개체들만을 선별하여, 어두운 국방색 1톤 FRP수조에서 수조당 150 inds./ton와 450 inds./ton 씩 2개의 실험구를 설정하여 2007년 4월 28일~2007년7월 28일까지 약 90일간 사육 실험을 실시하였다. 이 기간 동안 실험구별 일간개체당 사료섭식량(DFI), 사료효율, 성장, 생존 및 군집내 착색증 발현빈도와 개체별 무안측 착색률을 조사하였다. 사육 실험결과, FE의 경우 저밀도구(150 inds./ton) 123.4±0.4%에 비해 고밀도(450 inds./ton) 136.9±9.2%가 유의하게 높게 나타난 것을 제외하고, DFI, 성장 및 생존은 실험구간 유의한 차이가 없었다. 한편 흑화율 및 흑화빈도의 경우는 실험 종료시 실험구간 유의차를 찾아볼 수 없었지만, 전체 실험기간을 놓고 볼 때 고밀도구에서 흑화빈도가 높게 나타나, 군집내 흑화 진행이 저밀도에 비해 고밀도에서 빨리 진행된다는 사실은 확인할 수 있었다. 따라서 밀도는 군집내 개체별 흑화발현 여부에는 관여하는 것이 확인되지 않았지만, 적어도 군집내 흑화넙치 개체 증가 속도에는 영향을 미친다는 사실을 확인할 수 있었다.
6-2. 수조 색상의 영향
넙치의 무안측 흑화 발현에 있어 수조색상의 영향을 조사하기 위해 일련의 실험을 실시하였다. 본 실험을 위해 전장 4.46±0.06 cm, 무게 0.77±0.03 g의 치어를 이용해 120일간 실시하였다. 실험에 사용된 수조 및 색상은 1톤 FRP 수조이며, 대조구는 어두운 국방색 수조를 이용하였으며, 비교구는 흰색수조를 이용하였다. 실험기간동안 무안측 착색률과 더불어 일간사료섭식량, 사료효율, 성장 및 생존율을 조사하였다. 비록 생존율 및 사료효율에 있어서 두 실험구간 차이는 없지만, DFI와 성장은 흰색구가 국방색구에 비해 높게 나타났다. 그러나 무안측 착색 진행속도는 어두운 국방색 수조의 넙치들이 흰색의 밝은 색 넙치들 보다 빨리 진행된다는 사실이 확인되었지만, 실험 종료 시 착색률에 있어서는 두 실험구간 차이가 없어, 수조 색상이 무안측 착색 발현에 제한된 범위 (특정 시기 또는 조건)에서만 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다.
6-3. 수조 바닥 재질과 형태의 영향
사육수조의 바닥형태가 넙치의 무안측 흑화 발현에 영향을 미치는지 여부를 알아보기 위해, 3개월간 사육 실험을 실시하였다. 무안측 착색현상이 없는 넙치 양성어 (TL 30.5±0.2 cm, BW 285±3.5 g)를 준비한 뒤 3가지 형태의 국방색 FRP 수조로 옮겨 사육하였다. 첫 번째 수조는 바닥이 편평한 일반 수조(대조구), 두 번째는 바닥에 돌기가 있는 돌기형 수조, 그리고 세 번째는 바닥에 잠입기질이 있는 수조로 실험구를 구성하였다. 개시 3개월 후 각 실험구별 착색률을 측정하였다. 그 결과 대조구가 가장 높은 착색률을 보였고, 그 뒤를 이어 대조구의 절반 수준에서 돌기형 수조가 착색현상을 나타내어, 돌기형 수조가 어느 정도는 착색현상을 방지하는 것을 알 수 있었다. 한편 잠입기질이 제공된 실험구에서는 무안측 착색률 변화 흔적은 찾아 볼 수 없었다. 이상의 결과 무안측 착색현상을 방지하기 위한 가장 효율적인 방법은 수조 바닥에 잠입기질을 제공하는 것임을 알 수 있었다.
6-4. 잠입기질 색상의 영향
본 연구에서는 넙치 무안측 착색에 효과가 있는 것으로 알려진 잠입기질이, 색상별로 넙치 무안측 흑화에 어떤 효과를 나타내는지 검증하기 위해 무안측에 착색현상이 없는 치어(TL 6.5~6.6 cm, BW 2.55~2.67 g)를 이용하여 사육 실험을 실시하였다. 실험은 국방색 FRP 1톤 수조에서 90일간 실시되었으며, 실험구는 잠입기질이 없는 대조구, 흰색 잠입기질, 황토색 잠입기질 및 흑색 잠입기질로 설정하였다. 그 결과, 3개월 후 비록 대조구의 먹이 섭식량이 기질구들 보다 높을지라도, 크기 면에서는 대조구와 기질구 사이에는 차이가 없었다. 착색률은 기질구에 비해 대조구가 유의하게 높게 나타났다. 잠입 기질구 사이에서는 밝은 색의 기질구가 어두운색 기질구보다 보다 낮은 착색률을 보였다. 이상의 결과 잠입기질에 의해 넙치의 섭식 효율은 증진되며, 무안측 착색현상은 억제되는 것을 알 수 있었다. 더불어 기질의 색상은 유안측의 색상변화와 더불어 무안측의 착색현상에도 관여한다는 사실을 알수 있었다.
6-5. 잠입기질 제거와 월동기 동면 효과
본 연구에서는 무안측 흑화 현상의 발생학적 특성을 알아보기 위해, 두 가지 임상실험을 실시하였다. 첫 번째는 “무안측 흑화 현상은 제어법이 영위될 경우에만 억제가 지속되는지?”, 두 번째는 “무안측 흑화 현상은 성장 및 대사와는 어떤 관련이 있는가?”를 알아보기 위해 천연형질 발현 기술로 생산된 무흑화 넙치 양성어를 이용해, 잠입 기질이 제공되는 FRP 수조구(대조구), 잠입 기질이 없는 콘크리트 수조, 잠입 기질이 없는 FRP수조에서 추․동계 시즌 120일간에 걸쳐 사육 실험을 실시하였다. 실험 기간 중 일간 개체당 사료섭식량(DFI) 및 사료효율(FE)을 구하였고, 실험어의 성장도, 무안측 착색률을 60일 간격으로 조사하였다. 그 결과 실험구별 성장에는 차이가 없지만, 잠입 기질이 제공되지 않을 경우 DFI는 낮고 FE는 높은 것으로 나타나, 생산비용 측면에서 잠입 기질을 제공하는 것이 유리한 것으로 나타났다. 한편 무안측 체색발현의 경우 잠입 기질이 지속적으로 제공된 대조구의 경우 실험 기간 중 변화가 없었지만, 그렇지 못한 2개 비교구에서는 유의하게 나타나 체색발현이 증가하는 것을 알 수 있었다. 그러나 성장과 대사가 최저 수준으로 떨어지는 월동기인 60~120일 사이에는 비교구들의 무안측 체색변화는 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과 넙치의 무안측 흑화 현상은 천연형질 발현 기술이 해지될 경우 바로 재현될 수 있으며, 또한 월동기 저수온에 의해 성장과 대사가 정지 상태에 이를 경우 무안측의 체색발현은 제어기술 없이도 정지된다는 사실을 알 수 있었다.
7. 산업화 가능성 실험
7-1. 대량생산 예비실험
본 연구는 무안측 체색발현 제어기술의 산업화 가능성을 알아보기 위해, 인공종묘생산 단계에서 2번에 걸쳐 2곳의 사육 장소에서 현장 실험을 실시하였다. 1차 실험은 90일간 실시하였고, 2차 실험은 60일간 실시하였다. 실험용 수조는 원형 콘크리트 수조 (20 ton)를 이용하였다. 실험은 잠입 기질을 제공하고 반복구 없이 실시하였다. 개시기 실험어 크기는 90일간 실험에서 평균 전장 3.9±0.04 cm, 평균 체중 0.40±0.01 g의 개체를 사용하였으며, 60일간의 실험에서는 3.62±0.05 cm, 평균 체중 0.46±0.02 g 의 개체를 사용하였다. 실험결과, 성장도는 길이의 경우 1차와 2차 실험 모두 실험구별 유의차가 없는 것으로 나타났지만, 무게 성장의 경우의 1차와 2차 실험 모두 잠입기질 제공구의 성장이 대조구보다 느린 것을 알 수 있었다. 무안측 착색률은 1차와 2차 실험 모두 잠입 기질구에 비해 대조구가 높게 나타났다. 1차 실험의 경우 대조구는 사육기간 동안 지속적으로 착색률이 증가한 반면, 잠입 기질구는 개시 후 30일까지만 유의한 증가가 보였고, 이후에는 큰 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 한편 2차 실험의 경우 무안측 착색률은 대조구는 지속적인 증가세를 보인 반면, 기질구는 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과, 대량생산시험의 결과로 무안측 체색발현 제어기술의 적용 가능성은 확인할 수 있었으나, 실험실적 수준의 실험에서 확인된 것과 상반되게 기질구의 무게성장 속도가 다소 느린 점이 확인되어 향후 그 원인에 대한 분석 실험이 이루어져야 할 것으로 보인다.
7-2. 가자미목 어류 적용 실험
본 연구에서는 넙치의 무안측 체색발현 억제 기술이 다른 가자미목 어류인 강도 다리를 대상으로 적용 가능한지 여부를 알아보기 위해 사육실험을 실시하였다. 실험은 1톤의 진녹색 FRP 수조(대조구) 및 흰색 FRP 수조(실험구)를 이용하여 바닥에 잠입기질을 깔아준 상태에서만 실시하였다. 실험 개시 강도다리는 평균 전장 4.03±0.03 cm, 체중 0.18±0.02 g 크기로, 무안측 착색률은 12.48±1.02%인 개체들을 이용하였다. 사육 밀도는 300마리/ton로 120일간 실시하였다. 실험 기간 중 성장 및 착색률을 측정하여, 정상적으로 성장이 이루어지면서 무안측 착색현상이 억제되는지 여부를 확인하였다. 그 결과 실험구별 성장도는 길이의 경우 실험구간 유의차는 없었다. 그러나 무게 성장의 경우 실험 종료 시 진녹색 수조가 흰색수조보다 유의하게 빠른 성장을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 생존율의 경우 두 실험구 모두 폐사 개체가 없어 실험구별 차이가 나타나지 않았다. 무안측 착색률은 사육기간이 지속되면서 진녹색 수조에서 약간 증가한 반면, 흰색 수조에서는 거의 변화가 없어 무안측 착색이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 강도다리 양식시 무안측 착색억제 기술의 적용 가능성을 확인할 수 있었으며, 부가적으로 수조의 색상에 따라 성장과 무안측착색률에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
Abstract
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2. Results
2.1. Effects of environment factors on the occurrence of pseudo-albinism on the ocular side in cultured flounder, P. olivaceus
We examined the cause of albinism in a hatchery population of flounder in terms of environmental and nutritional factors, including the effects of light int
2. Results
2.1. Effects of environment factors on the occurrence of pseudo-albinism on the ocular side in cultured flounder, P. olivaceus
We examined the cause of albinism in a hatchery population of flounder in terms of environmental and nutritional factors, including the effects of light intensity (130~12,300 lux), photoperiod (12L/12D or 24L/0D), tank substrate (concrete or fiber-reinforced polymer), tank color (white or dark green) and supplement with enriched live food. We also compared the growth of normal and albino fry under both 12L/12D and 24L/0D. After rearing the albino fry for 2 years after their identification and classification, we investigated whether the skin pigmentation pattern on the ocular side normalized. Light intensity did not play a critical role in the development of normal pigmentation or albinism in the flounder. By contrast, the photoperiod was a weak inducer of albinism in the flounder. Tank substrate and color also affected the hypomelanosis on the ocular side of the flounder fry. The choice and supplementation of enriched live foods could drastically reduce the incidence of albinos in hatcheries. On comparing the growth of normal and albino fry, while there was no difference between the groups under 24L/0D, the growth of the albino flounder was slower under 12L/12D. Although coloration resulting from xanthophore and melanophore, but not iridophores, occurred on the ocular side, evidence of albinism remained on the ocular side of flounders.
2.2. Change of abnormal pigmentation on blind side of cultured flounder, P. olivaceus according to growth stage
In the present study, to understand a mechanism of abnormal pigmentation (hypermelanosis) in blind side of flounder, P. olivaceus, we investigated an date that blind side staining visible to ordinary sight is initially observed, and measured an individual staining spot number, staining rate and an occurrence frequence in crowd that are changed according to growth. The present experiment was initiated at 24-day after hatching (dah), just after metamorphosis, in which fish mean size is total length [TL] 12.4±0.2 mm and body weight [BW] 19.9±0.7 mg, and was finalized at 94-dah (TL 72.0±0.6 mm, BW 3,912.3±119.4 mg). The experimental animals were reared at 20±0.5℃ in water temperate and 30.9±0.1 in salinity. The experimental animals were feed with rotifer, Artemia nauplii and commercial food according growth stage. As results, the first staining spot in microscopy level was found at 38-day after hatching (TL 18.3±0.4 mm, BW 57.6±4.1 mg), but the first staining spot observed by naked eye was found 52-day after hatching (TL 37.6±0.5 mm, BW 534.2±30.9 mg). The staining spot sharply increased from 31-dah to 80-dah, and the staining rate sharply increased from 66-dah to 94-dah. The number of staining fish per group was increased from 45-dah to 73-dah, and then was stabilized to 94-dah. Therefore, these results indicated that the hypermelanosis in blind side of the flounder, P. olivaceus was a phenomenon that pigment cells is abnormally differentiated on the blind side just after metamorphosis in artificial culture system, and the staining spot constituted with the pigment cells was increased according to growth.
2.3. Physiological character between normal and hypermelano flounders, P. olivaceus reared in culture system
In the present study, to clarify a possible relevance of the hypermelanosis on the blind side to chronic stress in cultured flounders, P. olivaceus, a serial experiment was tried with comparison of stress factors between non-hypermelano and hypermelano flounders. The initial mean size of experimental animal was total length 21.5±0.42 cm and body weight 87.5±6.1 g. The staining rate on the blind side was 0.63±0.12% and 16.7±4.7 % in non-hypermelano and hypermelano groups, respectively. The stress factors surveyed in the experiment were glucose (GLU), total protein (TP), cortisol, free type-thyroid hormones (FT3 and FT4) in plasma, and also moisture, crude protein, crude lipid, and crude ash in body muscle. As a result, GLU and TP were higher in hypermelano group than in non-hypermelano group. Cortisol were also higher in hypermelano group than in non-hypermelano group. In FT3 and FT4, any difference between two groups was not observed. In body nutrient factors, the moisture and the crude ash in body composition were not different between two groups, but the crude protein was low and the crude lipid was high in the hypermelano. Therefore, it is concluded that the hypermelanosis on the blind side of cultured flounders could be deeply related with a chronic stress.
2.4. Possible relevance of molecular-endocrinology to hypermelanosis on blind side of cultured flounder
2.4.1. Possible relevance of MCH
To investigate the involvement of MCH with hypermelanosis in olive flounder, P. olivaceus. We studied the prepro-MCH cDNA sequence and its mRNA expression in the flounder, and compared prepro-MCH mRNA activities between normal and hypermelano flounders. We cloned and characterized cDNA encoding its prepro-MCH from the whole brain. Olive flounder prepro-MCH cDNA consists of 590 bp and encodes a protein of 135 amino acids including 24 signal peptides, and olive flounder-MCH consists of 51 bp and encodes a protein of 17 amino acids. Reverse transcription-PCR showed the MCH mRNA expression in the brain. Expression of brain MCH mRNA was significantly lower in hypermelano flounders than in normal fish. These results indicate that MCH could be related with hypermelanosis in olive flounder probably.
2.4.2. Possible relevance of POMC
To investigate the involvement of prepro-proopiomelanocortins (POMCs) with staining on the blind side of olive flounder, P. olivaceus, we surveyed tissue sites in which the POMCs genes are expressed, and compared ofPOMCs (ofPOMC-Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ) mRNA activities between the staining and non-staining on the blind side of the flounder. For the studies, we refereed to the information of ofPOMC-Ⅰ and Ⅱ genes in NCBI, but we try to find ofPOMC- Ⅲ sequence newly. At first, we cloned and characterized cDNA encoding its ofPOMC-Ⅲ from the pituitary of olive flounder The ofPOMC-Ⅲ cDNA consists of 1258 bp nucleotides and 7 peptides (Signal peptide, N-POMC, α-MSH, CLIP, N-β-LPH, β-MSH and β-END-like peptide) encoded in 231 amino acids. In the test of tissue distribution of ofPOMCs in olive flounder, we found that ofPOMC-Ⅰ is expressed in pituitary only, but ofPOMC-Ⅱ and Ⅲ are expressed in all tissues examined. In the comparison of ofPOMCs mRNA expression between the staining and non-staining, expression of ofPOMC-Ⅰ and Ⅱ mRNA was significantly higher in the staining groups than in non-staining group, but ofPOMC-Ⅲ was not significantly different between two groups.
2.5. Possible relevance of genetic breeding
2.5.1 Family population
Body color abnormality in blind side of olive flounder, P. olivaceus was found in a hatchery population. Their body color abnormality was not uniform and a large variation was observed. To examine genetic effects on the color abnormality and variation, this study estimated the degree of body color abnormality among total 498 individuals of F1 broodstock and differences of body color abnormality in blind side between two families, one (TD25) has high frequence of body color abnormality, and the other (TD22) has low frequence of body color abnormality. Significant differences between TD25 and TD22 family were observed in the degree of body color abnormality in blind side of olive flounder. These results indicated that the body color abnormality in blind side detected in F1 broodstock and two experimental families of olive flounder might be strongly heritable as observed in other fish species. Furthermore, the potential for improving natural body color in blind side of olive flounder by selective breeding is good because additive genetic variation for body color abnormality does exist within the hatchery population of olive flounder.
In addition, we present a strategy that allows rapid identification of candidate single-nucleotide polymorphisms (SNPs) using publicly available expressed sequence tag (EST) databases. SNPs represent a new form of functional marker, particularly when they are derived from expressed sequence tags (ESTs). In this study, a collection of 9,525 olive flounder ESTs was assembled into contiguous sequences (contigs), and then visually inspected to identify primer pairs capable of amplifying specific alleles. A total of 6,533 putative SNPs were identified using all existing and the newly generated EST resources of olive flounder. These putative SNPs can provide a rich source of useful molecular markers in genetic analysis, and can be used as excellent markers for genetic improvement of olive flounder through selective breeding.
2.5.2. Genetic and phenotypic parameter
Genetic and phenotypic parameter estimates for body color abnormality were obtained from F2 generation of olive flounder P. olivaceus. A total of 2,334 offspring, representing 177 full-sib families produced by 179 males and 177 female were tagged with PIT tag, and individual phenotypic characteristics such as body color abnormality in blind side were recorded. Parentage assignment using eight microsatellite markers was also performed, and all 177 families existed in 2,334 offspring. Genetic variance, residual variance and heritability at 87 days of age were estimated. Animal model heritability estimates were 0.11 for body color abnormality in blind side. The genetic correlation between body color abnormality and length was weakly positive (0.09). The results show that there is substantial additive genetic variance for body color abnormality in olive flounder that can be exploited through selective breeding.
Using the TaqMan SNP genotyping assay, we have been able to perform genetic association studies aimed at characterizing the genetic factors underlying inherited traits. In this study, we selected four polymorphic sites and three polymorphic sites with high allele frequency from hypoxia-related gene (hypoxia induced gene 1) and skin color-regulating gene (melanin concentrating hormone, MCH), respectively. A total of 2,500 samples (200 families) were analyzed with allelic discrimination using the TaqMan SNP genotyping assay, which consist of a mix of unlabeled polymerase chain reaction (PCR) primers and the TaqMan minor groove binding group (MGB) probe. Genotypes were determined visually based on the dye-component fluorescent emission data depicted in the X-Y scatter-plot of the SDS software. Finally, family-based association studies are carrying out to examine the genetic association of genotyped SNPs and haplotypes with body color abnormality in olive flounder.
2.6. Influence of rearing factors in the staining on the blind side of flounder
2.6.1. Influence of rearing density
To find whether rearing density affects pigmentation on the blind side of olive flounder, we performed a rearing density test at the densities of 150 inds./ton and 450 inds./ton for 90 days with olive flounder, Paralichthys olivaceus fries (TL 6.6±0.1 cm, BW 2.55±0.04 g) having no staining on the blind side. The test was done twice in dark-green FRP tanks. We surveyed daily food intake (DFI), food efficiency (FE), growth, survival, staining rates on the blind side and ratio of hypermelano fish at the final day. Although FE was significantly lower at 150 inds./ton than at 450 inds./ton, DFI, growth and survival were not significant different between two groups. In the staining rate on the blind side and ratio of hypermelano fish, there was also no significantly difference between two groups. However, ratio of hypermelano fish before 90 rearing days was higher at 450 inds./ton than at 150 inds./ton, indicating that hypermelanosis on the blind side progresses more rapidly in higher density than in lower density. Therefore, it is concluded that the rearing density could affects abnormal pigmentation on the blind side of flounder.
2.6.2. Influence of rearing tank color
To study the influence of the substrate and tank color on survival, DFI, FE, growth and blind side-hypermelanosis, we reared juvenile olive flounders, P. olivaceus (TL 4.46±0.06 cm, BW 0.77±0.03 g) duplicately for 90 days in dark green FRP aquarium without substrate (DF group, control), white FRP aquarium without substrate (WF group), and dark FRP aquarium with substrate (DG group). Although there was no differency in survival rate, DFI was the highest in WF, but the lowest gravel. In growth, WF was also the fast, but DF and DG were slower significantly. However, FE was the highest in DG group, but the lowest in WF gorup. In the rate of hypermelanosis, a clear difference was observed in blind side among groups. The rate is significantly lower in DG group with substrate than that in DF and WF gorups without substrate. Therefore, we concluded that thank color affects the DFI, growth and FE, but not any affects the repression of hyper-pigmentation on the blind side. However, the substrate on the tank bottom could inhibit the staining (hypermelanosis) on the blind side of flounder
2.6.3. Influence of the material and forms of tank bottom
Whether the tank bottom types could prevent the hypermelanosis on the blind side of flounder, we examined an rearing test for 3 months. We prepared flounders (TL 30.5±0.2 cm, BW 285±3.5 g) having no staining on the blind side, and then transferred them to flat dusky green tank (control), projecting dusky green tank (projecting group), and to substratum dusky green tank (substratum group) that gravel was placed in bottom. The test was performed twice. At three months after initiation, we measured the staining percent on the blind side of flounder. The staining percent in flat and projecting groups were more rapidly increased than in the substratum group. Especially, the staining rate in flat group was faster about two times more than in the projecting group. The percent in substratum group was not changed as the initial time. These results indicated that the best effective method to prevent sating on the blind side of the flatfish is a method that try to place a gavel on the bottom in tank, but projecting bottom was not effect to prevent the staining of the flatfish.
2.6.4. Effects of substratum color
A pleuronectiform fish, the olive flounder, P. olivaceus, is promising for aquaculture and resource enhancement in South Korea due to its high commercial value. A major problem in the culture of olive flounder is staining on blind side (pigmentation of the skin on non-eyed side) under culture conditions since it diminishes the commercial value of the fish. Here, we prepared fries (TL 6.5~6.6 cm, BW 2.55~2.67 g) having non staining by rearing from hatching stage with a dusky green tank without substratum on the bottom, and transferred them to dusky green tanks without substratum or with substratum (white, yellow, and black small gravels). we examined whether the employment of gravels (yellow, white, black; approximately 3~5 mm), as substratum could prevent hypermelanosis occurrence on blind side of flounder and color of substratum, could influence a degree of hypermelanosis. Three months later, although food intake of control was higher than that of substratum groups, there was no difference between control and substratum groups in size. The percent area of hypermelanosis in fish reared in dusky green tanks with color gravels was significantly smaller than that of fish in a dusky green tank without substratum. The percent area of hypermelanosis in fish lived under bright color substratum was significantly smaller than that of fish under dark color gravel. These results indicated that the feed efficiency of olive flounder is promoted by substratum with the exception of yellow gravel group, the occurrence of staining was suppressed by employment of small gravel (approximately 3~5 mm), and color of substratum affected the non-eyed side color in addition to the physiological color change on the eyed side.
2.6.5 Effects of removing substratum from tank and hibernation in winter season
In the present study, we performed an experiment to clarify two question on the forming the staining on the blind side of the flounder. The first question is that the inhibition of staining on the blind side of juvenile flounders reared in substratum tank would be still without substratum in tank. The second question is that the staining would be related with growth and metabolism. The rearing experiment was performed in substratum FRP tank (S-FRP; Control), non-substratum concrete tanks (NS-concrete) and non-substratum FRP tank (NS-FRP) using the non-staining juvenile flounders for 120 days from fall and winter season. We surveyed daily food intake (DFI), food efficiency (FE), growth and staining rate on the blind side at 60-day intervals. Although we did not find any difference among groups on growth, we observed there were significantly different on DFI, FE and the staining rate. DFI and FE were lower and higher in substratum tanks than non-substratum tank, suggesting that substratum in tank could be of economical benefit to flounder culture. The staining rate was not increased in substratum tanks, but was increased in non-substratum tanks. We found that the staining both in non-substratum groups for winter season was stop, indicating the phenomenon should be together with growth and metabolism. In conclusion, the staining on the blind side of flounder can not inhibited without substratum in tank, also is manifested with growth.
2.7. Test of possibility for practical use in flounder culture industry
2.7.1. Preliminary mass culture test
To find a possibility to apply the technique inhibiting pigmentation on the blind side of flounder using substratum to mass seedling production of flounder, mass culture testes were done twice in two artificial seedling production facilities. The first test was done for 90 days and the second for 60 days. The tanks used in the present study were two 20-ton concrete tanks with non-substratum (control) and substratum. The rearing was once a test. The experimental animals was olive flounder flies without staining on the blind side. The initial size of experimental animals used were TL 3.90±0.04 cm and BW 0.40±0.01 g at the first test, and were TL 3.62±0.05 cm and BW 0.46±0.02 g at the second test. As a result, it was showed that length growth was not different between non-substratum (control) and substratum, but body growth was slower in the substratum concrete tank than in non-substratum concrete tank in both testes. Also, although the staining rate on the blind side of the fished in substratum tank increased a little until 30 day in 1st test, it was certified that staining on the blind side was effectively inhibited by substratum. So, we concluded that the technique could apply to mass production of flounder seedlings having non-staining on the blind side. In the future, more studies will be performed for the mass production of flounder fries not pigmented on the blind side
2.7.2. Preliminary test for practical use in the starry flounder culture
In the present study, we performed an preliminary rearing experiment to clarify a possibility that the technique inhibiting the blind side staining of olive flounder using substratum can apply to other flatfish. Also, we certified whether tank color could affect the growth and staining rate of flatfish. For this test, we used starry flounder, Platichthys stellatus be without staining on the blind side, and reared the fishes in dark-green FRP and white FRP tanks with substratum for 120 day. The initial mean total length and body weight of experimental animals were 4.03±0.03 cm and 0.18±0.02 g, respectively, and the initial mean staining rate on the blind side was 12.48±1.02%. Rearing density was 300 inds./ton. To clarify whether the staining on the blind side of the starry flounder was inhibited with growth, the animal size and the staining rates of the fish were measured at 60-day intervals. As a result, we found that staining on the blind side could be inhibited by substratum in both color tanks with normal growth. In addition, because the body weight of flatfish in white tank was lower than the fish in dark-green tank, we found that the growth of flatfish could be slow by light tank color. Therefore, we know that the technique inhibiting staining on blind side of olive flounder could apply to another flatfish, and light color of tank can affects the growth of the fish, but do not affect the staining.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 17
- CONTENTS ... 27
- 목 차 ... 31
- 제1장. 연구개발 과제의 개요 ... 34
- 제 1 절. 연구개발의 목적 ... 34
- 제 2 절. 연구개발 필요성 ... 36
- 제1항. 기술적 측면 ... 36
- 제2항. 경제⋅산업적 측면 ... 36
- 제3항. 사회⋅문화적 측면 ... 37
- 제2장. 국내외 기술개발 현황 및 과학기술정보 ... 38
- 제3장. 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 39
- 제 1 절. 양식산 넙치의 유안측 백색증 발현에 미치는환경인자들의 영향 ... 39
- 1. 재료 및 방법 ... 41
- 2. 결과 및 고찰 ... 44
- 3. 요 약 ... 49
- 제 2절. 양식산 넙치의 성장단계별 무안측 흑화 발현 양상 ... 50
- 1. 재료 및 방법 ... 53
- 2. 결과 및 고찰 ... 55
- 3. 요 약 ... 61
- 제 3 절. 무안측 흑화 넙치의 생리학적 특성 ... 62
- 1. 재료 및 방법 ... 64
- 2. 결과 및 고찰 ... 67
- 3. 요약 ... 69
- 제4 절. 넙치의 무안측 흑화 발현에 있어 분자내분비적관련성 ... 70
- 제1항. MCH 관련성 ... 70
- 제2항. POMC 관련성 ... 85
- 제5절. 유전육종학적 관련성 ... 101
- 제1항. 가계군집간 관련성 ... 101
- 제2항. 유전학적 표현 인자 ... 111
- 제6절. 무안측 흑화 발현에 있어 서식 환경의 영향 ... 128
- 제1항. 사육 밀도의 영향 ... 130
- 제 2항. 수조 색상의 영향 ... 138
- 제3항. 수조 바닥 재질의 영향 ... 148
- 제4항. 잠입기질 색상의 영향 ... 154
- 제 5항. 잠입기질 제거와 및 월동기 동면 효과 ... 164
- 제 7 절. 산업화 가능성 실험 ... 171
- 제1항. 대량생산 예비실험 ... 171
- 제2항. 가자미목 어류 적용 실험 ... 177
- 제4장. 연구개발 목표달성도 및 관련 분야에의기여도 ... 183
- 제1절. 연구개발목표의 달성도 ... 183
- 제2절. 관련 분야의 기술 발전에의 기여도 ... 184
- 제5장. 연구개발 결과의 활용계획 ... 186
- 제6장. 참고문헌 ... 188
- 끝페이지 ... 203
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