초록 ▼

○ 연구결과
가. 느티나무 추출성분 분리 및 유효물질 구조 동정
(1) 카달렌 추출
수령 20 - 30 년생 느티나무 수종을 채취한 후 기건하여 심재, 변재, 수피와 잎으로 나누어 볼밀을 이용하여 60 mesh 크기로 분쇄한 느티나무 분말(12kg)을 에탄올로 72시간씩 3회 추출하여 감압, 농축하였다. 에탄올 농축액은 헥산으로 추출한 후에 헥산분획물은 실리카젤로 충진된 칼럼 크로마토그라피(5.5 x 53cm)로 카달렌을 단리하여 24시간 동결건조 하였다.
단리한 카달렌은 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를

○ 연구결과
가. 느티나무 추출성분 분리 및 유효물질 구조 동정
(1) 카달렌 추출
수령 20 - 30 년생 느티나무 수종을 채취한 후 기건하여 심재, 변재, 수피와 잎으로 나누어 볼밀을 이용하여 60 mesh 크기로 분쇄한 느티나무 분말(12kg)을 에탄올로 72시간씩 3회 추출하여 감압, 농축하였다. 에탄올 농축액은 헥산으로 추출한 후에 헥산분획물은 실리카젤로 충진된 칼럼 크로마토그라피(5.5 x 53cm)로 카달렌을 단리하여 24시간 동결건조 하였다.
단리한 카달렌은 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 정성적, 정량적 분석을 실시하였다. 분리한 카달렌은 구조 동정을 위하여 CD₃OD에 녹여서 기초과학지원연구원 서울분소에서 1H- 및 13C-NMR (Varian, 500MHz)을 측정하였으며, 분자량은 EI 및 CI-MS (JMS-600W,JOEL)로 분석하였다.
(2) 느티나무 에탄올 조추출액의 항균 활성 검정
항진균활성용 공시균으로서는 식물병원균 4종, 목재 부후균 4종 및 표고해균 1종 등 9종과 항세균활성용 공시균으로서는 그람양성균 3종, 그람음성균인 4종을 사용하여 항진균활성검정방법으로는 배지점적법을 그리고 항세균활성은 한천배지확산법을 이용하여 항균활성을 조사하였다.
(3) 카달렌의 생리활성 검정
카달렌의 생리활성은 Hydroxy radocal(ㆍOH) 및 superoxide radical 소거활성과 멜라닌 미백효과, Esterase 저해능 및 MTT assay에 의한 카달렌의 세포생존율을 평가하였으며 폐암세포에 대한 글루코오스 대사 억제 실험을 실시하였다.
(4) 느티나무 연륜별 카달렌의 분포조사
2령급(14년생)과 3령급(30년생) 느티나무의 각 부분을 연륜 별로 각각 분리한 다음 60mesh 크기로 분쇄한 시료(5-10g)를 에탄올로 추출하고 헥산으로 용매분획하여 HPLC로 카달렌을 정량 분석하였다.
(5) 느릅나무과 수종에서 카달렌 및 카달렌 동족체 분리
느릅나무과에 속하는 수종 중에서 느릅나무(Ulmus davidiana Planch.), 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.), 큰잎느릅나무(Ulmus crophylla Nak.)와 당느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance.)등 4수종의 목분을 에탄올로 추출하고 헥산으로 용매분획하여 HPLC로 카달렌과 카달렌 동족체들을 정성 분석하였다.
(6) 카달렌의 유도체 합성 및 활성 조사
카달렌(7-Hydroxy-3-methoxycadalene)으로부터 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene으로부터 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene과 7-O-β-D-cellobiosyl-3-methoxycadalene을 합성한 후 화학구조와 분자량은 EI-MS와 ¹H- 및 ¹³C-NMR 분석으로 확인하였다.
카달렌을 복강 내 반복투여 시 나타나는 독성의 경감을 위하여 카달렌에 글루코오스 치환에 의한 수용성을 증가시켜 그에 대한 세포독성을 실험하였다.
나. 세포주기 조절억제에 의한 폐암예방 및 치료제 개발
(1) 카달렌이 폐암세포주기 및 MAPK pathway에 미치는 메커니즘
A549 cell을 tissue culture flask에 plating하여 24시간 동안 배양한 후 설정한 용량의 cadalene을 농도별로 다시 24시간 처리하여 cell을 propidium iodide로 염색 후 flowcytometry를 이용하여 세포주기를 측정하였다.
cadalene을 처리한 A549 cell lysis한 후 원심분리한 상층액에 대해 G1, G2/M checkpoint 및 protein translation에 미치는 영향을 Western blot으로 측정하였다.
(2) 카달렌의 항산화효과 검정
카달렌의 항산화 효과는 Luciferase assay법으로 하였는데 NF-kB 유전자가 들어있는 firefly luciferase reporter vector와 internal standard로서 pRL-SV40 renilla luciferase reporter vector를 FuGene6 transfection reagent를 이용하여 세포 내에 transfection하여 24시간 후 cadalene을 처리하고 다시 24시간을 배양한 다음 세포를 용해시켜 NF-kB의 발현율로써 조사하였다.
(3) 카달렌의 세포사멸 효과
Apoptosis assay는 Annexin V-FITC apoptosis detection kit을 사용하여 flow cytometry로 분석하였다.
다. 생체내 안전성 평가
(1) 단회투여 독성 시험평가
실험동물은 SPF (특정병원체 부재) ICR계 마우스를 중앙실험동물로부터 분양받아 약 1주일간 사육실에 순화 적응시킨 후 건강한 동물을 선택하여 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10 %, 배기 10-12회, 형광등 명암 12 hr cycle, 조도 150∼160 Lux로 전 시험기간동안 실험동물용 케이지에 5마리씩 넣어 시험하였으며, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군분리를 실시하였으며 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 시험군으로는 대조군을 Ethanol을 control으로 하여 3개 농도의 실험군을 설정하였다. 각 군당 암ㆍ수 각 5 마리씩을 설정하였으며, 시험군으로는 저용량군(25 mg/kg), 중용량군(50 mg/kg) 및 고용량군(100 mg/kg)을 설정하였다. 각각의 용량군에 복강내투여를 실시하여 cadelene의 안전성을 평가하였다.
모든 실험동물에 대한 임상증상은 투여당일에는 투여 후 6시간동안 매시간 관찰하였으며, 그 후부터는 1일 1회 14일간, 운동성, 외관, 자율신경증상, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여후 시험물질에 의해 나타날 가능성이 있는 증상에 대해 주의하여 관찰하였다. 시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여당일(0일), 7일, 부검시(14일)에 체중을 측정하였다.
시험 중 폐사동물은 그때마다 부검을 실시하였고, 시험종료시 생존동물은 경추탈골로 치사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 육안적 이상장기와 조직은 10% 중성포르말린에 고정하였다.
(2) 반복투여 독성 시험평가.
단회투여 독성 평가로 산출된 LD₅₀의 1/10을 암컷, 숫컷 각각의 고용량군으로 설정하여 복강내 반복투여 시 실험동물에게 있어서 1주일 내, 전 개체 사망이 관찰되었다. 이러한 독성반응을 고려하여 반복투여 독성평가 시에는 복강내 투여가 아닌 Corn-oil에 현탁하여 경구투여로 투여경로를 변경하였다.
순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군분리를 실시하였으며 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 시험군으로는 대조군을 Ethanol을 control으로 하여 3개 농도의 실험군을 설정하였다. 각 군당 암ㆍ수 각 10 마리씩을 설정하였으며,시험군으로는 단회투여독성 평가시 산출된 LD50의 1/10을 암컷, 숫컷 각각의 고용량군으로 설정하여 숫컷 저용량군(1.1 mg/kg), 중용량군(2.2 mg/kg) 및 고용량군(4.4 mg/kg)으로 암컷 저용량군(0.475 mg/kg), 중용량군(0.95 mg/kg) 및 고용량군(1.9 mg/kg)으로 설정하였다. 각각의 용량군에 경구투여를 실시하여 cadelene의 안전성을 평가하였다.
모든 실험동물에 대한 임상증상은 1일 1회 28일간, 운동성, 외관, 자율신경증상, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여후 시험물질에 의해 나타날 가능성이 있는 증상에 대해 주의하여 관찰하였다.
시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여 시작일, 7일, 14일 21일 부검시(28일)에 체중을 측정하였다.
시험 중 폐사동물은 그때마다 부검을 실시하였고, 시험종료시 생존동물은 경추탈골로 치사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 육안적 이상장기와 조직은 10% 중성포르말린에 고정하였다.
투여 종료 후 대조군과 시험군의 모든 실험동물을 안와정맥으로 채혈하였으며 채혈이 끝나면 경추탈골로 안락사 시킨 후 부검을 진행 하였으며 육안적인 장기의 이상 유무를 관찰하였다.
실험동물에 대해 시험물질 노출 종료 하루전 절식 시켰으며, 부검 전 모든 실험동물을 안와정맥으로 채혈하였다. 혈액검체는 혈액 응고방지제(EDTA)가 들어있는 채혈병에 채집하였으며, 자동혈구 계수기(Hemacyte., Oxford Science Inc)를 이용 백혈구수 (white blood cell or leukocyte count, WBC), 적혈구수 (red blood cell or erythrocyte count, RBC), 혈색소 농도 (hemoglobin concentration, HGB), 적혈구용적 (hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적 (mean corpuscular volume, MCV), 평균 혈색소량 (mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 혈색소농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration; MCHC), 혈소판수 (platelet or thrombocyte count등의 항목에 관하여 측정하였다.
혈액생화학적 검사 또한. 안와정맥으로 채혈한 후 혈액을 1,500 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으나, 다양한 혈액생화학항목을 분석하기에는 실험동물인 마우스 특성상 그 양이 적기에 증류수에 2배 희석하여 혈액생화학분석기(Prime)를 이용하여 TP(total protein),ALB(albumin), TB(total bilirubin), AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase), GLU(glucose), CREAT(creatinine), B.U.N.(blood urea nitrogen), TG(triglycer),Ca(calcium), P(phosphor), LDH (lactate dehydrogenase), CHOL (cholesterol), ALP (alkaline phosphatase) 항목을 측정하였다.
채혈 후 모든 동물을 부검하였으며 이때 육안적 관찰을 동시에 진행하였다. 뇌, 심장, 흉선, 폐장, 간장, 신장, 부신, 비장, 고환, 난소, 안구, 비강을 적출하고 그 중 뇌, 심장, 흉선, 폐장, 간장,신장, 비장, 고환, 난소 중량을 측정한 후 모든 장기는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하였다. 장기 조직은 파라핀에 포매하고 H&E(Hematoxylin and Eosin)염색을 하여 광학현미경에 의한 병리조직학적 검사를 하였다.
라. 결과
(1) 느티나무 추출성분 분리 및 유효물질 구조 동정
본 연구는 느티나무에서 단리한 카달렌의 폐암세포 증식억제 효과를 이용하여 효과적인 폐암치료제 개발 목적으로 카달렌의 화학적 특성 규명과 폐암세포에 미치는 의학적, 생물학적 특이성 규명에 초점을 맞추어 수행하였다.
카달렌은 느티나무 분말을 에탄올로 추출한 후에 이를 헥산으로 분획하여 실리카 젤 칼럼으로 단리 하였다. 카달렌의 수율은 느티나무 전건무게의 약 0.3% 정도를 차지하였다. 단리한 카달렌을 기기분석으로 그 구조를 동정한 결과, 분자량은 244(m/z)으로 측정되었으며, 7번 위에 수산기가, 3번 위치에 메톡실기가 치환된 7-hydroxy-3-methoxycadalene 구조로 나타났다. 이러한 나프탈렌 구조의 카달렌은 천연물화학 분야에서 탄소가 15개인 sesquiterpene류로 분류되고 있다.
느티나무 부위별, 연륜별로 카달렌의 분포를 조사한 결과, 카달렌은 느티나무 수피나 잎에서는 전혀 발견되지 않았다. 또한 목부에서도 변재부에는 전혀 존재하지 않고 심재부에서만 발견되는 특성을 발견하였다. 이러한 생화학적 특성으로 미루어 카달렌은 변재와 심재부 사이에 있는 유세포조직에서 합성되어 심재부로 이동하는 전형적인 심재형성물질로 추정된다.
느티나무 심재부에서 획득한 헥산분획물의 HPLC분석결과에 의하면 카달렌을 제외하고도 여러 화합물들이 존재하고 있는 것으로 나타났다. 따라서 헥산분획물의 HPLC 크로마토그램에서 나타나는 각 피크들을 prep HPLC를 이용하여 분리한 결과 총 9종의 화합물을 단리 하였다. 이 중에서 3종의 화합물은 ¹H-NMR, ¹³C-NMR와 EI-MS 등 기기분석을 통하여 구조 동정에 성공하였다. 아래 그림에서 보듯 이들 화합물은 모두 카달렌의 기본 골격을 유지하고 있어서 느티나무에 존재하는 카달렌 동족체로 분류될 수 있다.
분류학적으로 느티나무가 속한 느릅나무과 수종 - 느릅나무, 참느릅나무, 당느릅나무와 큰잎느릅나무 - 을 대상으로 카달렌 분리를 시도하였다. 느릅나무과 수종에서는 카달렌과 동일한 구조의 카달렌은 발견되지 않았다. 그러나 느티나무와 유사하게 느릅나무과 수종 심재부에서 카달렌과 유사한 구조의 화합물인 7-hydroxy-cadalene이 검출되었는데, 이는 카달렌 생합성과정 중 카달렌의 전구물질의 하나로 예측되었으며, 생합성 과정에서 hydroxylase와 O-methyltransferase라는 효소의 작용으로 카달렌이 합성되는 것으로 사료된다. 이러한 결과로 미루어 카달렌은 느릅나무과 수종 중에서 단지 느티나무에서만 생합성되는 화합물로 잠정적으로 결론지을 수 있다.
카달렌은 hydroxy radical(ㆍOH) 소거능력이 탁월한 것으로 나타났다. Hydroxy radical(ㆍOH)은 카달렌 농도에 비례하여 소거능력을 나타냈는데, 카달렌 농도 100ppm에서 hydroxy radical(ㆍOH)이 거의 100% 가 제거되었다. 그러나 카달렌의 MTT assay 측정결과에 의하면 카달렌은 세포독성을 띠고 있는 것으로 판명되었다. 카다렌 농도 1ppm에서는 약 90% 가량의 세포생존율을 보였으나, 9ppm에서는 세포생존율이 22%로 크게 낮아지는 점으로 미루어 카달렌 농도가 높아질수록 현저한 세포독성 효과를 보였다.
이러한 세포독성은 카달렌을 식품첨가제나 의약품으로 적용할 경우 부작용이 발생할 가능성이 있으므로 이를 최소화하기 위한 방편으로 카달렌 분자의 7번 위치에 존재하는 수산기에 글루코오스 분자 1개를 부착하여 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene(분자량 406 m/z)을 합성하였다(수율 45%).
(2) 세포주기 조절억제에 의한 폐암예방 및 치료제 개발
카달렌을 마우스 복강 내 고농도 (100 mg/kg), 중농도 (50 mg/kg), 저농도 (25 mg/kg) 단회투여독성평가 결과 시험기간 내에 유의성 있는 체중변화량은 관찰되지 않았으며 LD₅₀는 수컷에서 43.59 mg, 암컷에서 18.63 mg을 나타냈다.
LD50의 1/10을 고농도 (수컷 : 4.4 mg/kg, 암컷 : 1.9 mg/kg)로 정하여 중농도 (수컷 : 2.2mg/kg, 암컷 0.95 mg/kg), 저농도 (수컷 : 1.1 mg/kg, 암컷 0.48 mg/kg)의 용량을 4주간 복강 내반복투여독성평가 결과 수컷, 암컷 모든 실험 군에서 실험동물의 폐사가 나타났다.이후 카달렌의 용매인 에탄올을 DMSO로, 투여경로를 복강이 아닌 경구로 전환하여 4주간 같은 농도로 반복투여독성평가 결과 시험기간 동안 수컷 대조군, 중농도군 에서 개체 간 각각 1마리씩의 사망개체가 발생 하였으나 암컷에서는 사망개체가 발생하지 않았다. 체중변화는 수컷과 달리암컷에서만 유의성 있는 변화가 관찰되었는데 특히 암컷에게 있어서 4주차 대조군 대비 유의성있게 체중감소가 나타났다.
혈액검사결과와 혈청검사결과의 몇몇 지표에서 대조군 대비 유의성이 관찰 되어졌지만 병리조직학적 소견에서는 카달렌 투여와 연관성이 있다고 판단되어지는 소견을 관찰할 수 없었다. 따라서 본 시험에서 표적장기는 판단할 수 없었으며 조직병리학적 측면에서 무독성량(No observed adverse effect level, NOAEL)은 수컷에서는 2.2 mg/kg과 암컷에서는 0.48 mg/kg 보다 적을 것으로 추정되고 있다.
본 결과로 비추어 볼 때 카달렌은 수컷보다는 암컷마우스에 독성이 더 잘 나타나는 것으로 판단된다. 현재 암컷과 수컷에 따른 독성의 차이를 밝히기 위한 연구가 진행 중에 있다. 이를 종합해보면 카달렌은 용매로 사용된 에탄올과의 상가 작용을 통해 그 독성이 증가되어지는 것으로 생각되어지며 따라서 복강 내 투여 보다 경구내 투여가 그리고 용매로서 에탄올보다 DMSO가 상대적으로 안전한 것으로 생각되어진다.
카달렌에 글루코오스 1분자를 부착한 7-O-β-D-glucopyranosyl-3- methoxycadalene는 반수치사율(IC50)이 88.6 μM로 측정되어 카달렌의 반수치사율 3.2 mM와 비교하여 세포독성이 약 20배이상 낮아지는 것으로 측정되었으며 물에 대한 용해고도 훨씬 향상된 것으로 나타났다. 폐암 세포주 대비 정상세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene을 대상으로 WI-38 cell line과 같은 normal lung cell line을 이용한 추가적인 실험결과 WI-38 cell에서 IC50는 298.2μM로 그 효능이 폐암세포인 A549에 비해 상대적으로 낮아짐이 관찰되어졌다.
이는 카달렌에 글루코오스가 치환됨으로서 normal lung cell line인 WI-38 세포 보다 폐암세포인 A549 세포에 더 효과가 있음을 암시하여 7-O-β-D-glucopyranosyl-3- methoxycadalene가 카달렌보다 폐암세포 증식억제에 특이적인 효과를 나타 낼 수 있는 가능성을 제시해 주며 추가적인 실험을 통해 그 작용기전에 관한 보다 명확한 규명이 요구된다.

Abstract ▼

1. Purification and identification of biologically active compounds from Zelkova tree (Zelkova serrata Makino.)
Cadalene was Isolated from hexane fraction of ethanol extracts of Zelkova wood powder using successive silica gel column chromatography. The cadalene yield amounts to 0.3% based on dri

1. Purification and identification of biologically active compounds from Zelkova tree (Zelkova serrata Makino.)
Cadalene was Isolated from hexane fraction of ethanol extracts of Zelkova wood powder using successive silica gel column chromatography. The cadalene yield amounts to 0.3% based on dried wood powder, Instrumental analysis including EI/MS, 1H-NMR, 13C-NMR revealed that its molecular weight was measured to 244 m/z and hydroxyl group was positioned at C7 and methoxyl group at C3. Cadalene (7-hydroxy-3-methoxycadalene) structure was similar with naphthalene form and was classified into sesquiterpene group, constructed with 15 carbons, in the field of natural product chemistry.
Topochemical study of Zelkova tree suggested that cadalene was found only xylem tissues in zelkova wood, not in leaves and bark. Furthermore, cadalene was specifically embedded only in heartwood tissue, absolutely not in sapwood. This physiological feature of cadalene firmly indicates that cadalene could be one of typical substances related to heartwood formation and transported to pith direction after biochemically synthesized in parenchyma cell between sapwood and heartwood.
HPLC analysis of hexane fraction of Zelkova heartwood suggested that several compounds co-existed with cadalene. Each peak on the HPLC chromatogram worked with preparative HPLC technique and 9 coumpounds were purified from hexane fractions. Among them, three compounds were characterized to their chemical structures with the help of 1H-NMR, 13C-NMR and EI-MS. As indicated below, their structures were similar to that of cadalene, thus these compounds could be also synthesized by the same biochemical routes as cadalene.
We attempted to purify cadalene and its related compounds from the Ulmus species, such as Japanese Elm (Ulmus davidiana), Chinese Elm (Ulmus parvifolia), Ulmus macrocarpa, Ulmus macrophylla. No cadalene was found in the Ulmus species except Zelkova. However, 7-hydroxycadalene, which is very similar structures with cadalene, was identified only in heartwood of all Ulmus species including Zelkova tree. Therefore, it is temporarily concluded that cadalene can be biochemically synthesized from 7-hydroxycadalene by the successive function of two enzymes in parenchyma cell such as hydroxylase and O-methyltransferase.
Cadalene has several excellent biological activities, like scavenging activity of hydroxyl and superoxide radicals. The scavenging activity of hydroxyl radical was intended to be increased in proportion to cadalene concentration. At 100 ppm concentration of cadalene, almost complete hydroxyl radicals was removed. However, MTT assay revealed that cadalene at high concentration showed critical toxicity to the cells. When 1 ppm of cadalene was treated to the cells, cell viability was reached up to 90 %, while it was reduced to 22 % after treatment of 9 ppm of cadalene.
To reduce the cell toxicity, cadalene was chemically modified to 7-O-β- D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene (Mw 406 m/z) via substitution reaction of hydroxyl group with glucose molecule. As a result, the cell toxicity, determined to IC50 value, was lowered more 20 folds than that of cadalene itself. In addition, the solubility to water was much more improved.
2. The development of lung cancer drug by cell cycle control
For better understanding of the mechanisms of cadalene on lung cancer cell growth arrest, A549 cells were treated with different concentrations of cadalene, then effects of cadalene on apoptosis were examined by flow cytometry. Our results clearly demonstrated that cadalene suppressed the G1 and G2/M phase in a concentration-dependent manner, thus, increased the apoptotic phase. Our data suggest that cadalene may exert its anti-cancer effects through facilitating the apoptosis.
Cadalene also induced the suppression of the proteins associated with G1, and G2/M checkpoint. Especially, the expression of cyclin A, B, D was significantly decreased by cadalene treatment. Moreover, protein expression of p21, p27, GADD45 and PCNA was also suppressed by cadalene. Our data suggest that cadalene may suppress lung cancer cell growth by controlling the cell cycle.
Cadalene increased the PTEN, strong tumor suppressor gene significantly while decreasing the other important proteins on protein translation pathways. Especially, cadalene suppressed the expression of total Akt as well as phosphorylation of Akt which is known to play a key role in lung tumorigenesis. Such decreased Akt and phospho-Akt protein expression was clearly re-confirmed by Akt and mTOR kinase assays. Immunohistochemistry of p-Mnk also supported our credit of data. Together, cadalene may suppress the lung cancer cell growth through controlling the protein translation.
Glucose is one of important energy source for cancer cell growth. Therefore, potential effects of glucose uptake by cadalene was examined. Our resulsts clealry demonstrated that cadalene could disturb the glucose uptake efficiently suggesting that part of antitumor effects of cadalene may be closely associated with selective interruption of glucose uptake.
For the single dose toxicity test of cadalene, mice were treated with different concentrations of cadalene (100, 50, and 25 mg/kg dissolved in ethanol) intraperitoneally. Such single dose toxicity study provided the LD50s of 43.59 mg/kg (male) and 18.63 mg/kg (female).
For 28-day repeat dose toxicity test, 3 different doses were determined based on above LD50 values. Briefly, 1/10th of LD50 was chosen as highest dose. From there, 3 different doses were determined (for male mice; 4.4, 2.2, and 1.1 mg/kg: for female mice; 1.9, 0.95 and 0.48 mg/kg). During the 4 weeks toxicity test period, all mice treated with cadalene in all different doses were dead.
Our next question was how to decrease the toxicity. To minimize or decrease the toxicity of cadalene, cadalene was dissolved in DMSO instead of ethanol and gavage was selected as a route of administration instead of intraperitoneal administration. With changed status, independent 28-day repeat dose toxicity was performed again. In the study, 1 mouse in control and 1 mouse in middle dose group were dead, however, such death was not closely associated with cadalene itself because other mice in all groups were alive. Moreover, no female mice were dead during the study period. Significant decrease of body weight was observed in female mice only, expecially in 4th week. Based on hematological, serum biochemical analysis and histopatholoigcal examination, no observed adverse effect level (NOAEL) was determined as 2.2 mg/kg for male mice and 0.48 mg/kg for female mice. Our results strongly suggest that there is a sex-dependent toxicity of cadalene. Extensive studies are under progress to elucidate such sex-dependent toxicity. Together, toxicity of cadalene may be increased by the use of ethanol and intraperitoneal administration. Therefore it is highly recommended that oral administration with DMSO for safe application of cadalene.
Our next question was how to decrease the potential toxicity of cadalene and maximize the potential efficacy of cadalene. For the purpose, hydroxyl group at 7 position of cadalene was replaced with glucose. Based on try and error, we synthesized 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene and such cadalene glucoside was easily soluble in water and IC50 against human lung cancer cell line (A549) was 88.6 μM. Next step, we were interested in IC50 values of cadalene glucoside in normal lung cells.
However, IC50 valueon normal lung cells was much lower than that on lung cancer cell line; 298.2μM on WI-38 cell line.
Taken together, cadalene, extracted from Zelkova tree, has strong antitumor activity. However, some degree of intrinsic toxicity may hinder the practical application. Additional study for decreasing the toxicity whereas increasing the efficacy is desperately needed.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 4
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 12
• 제 1 장 서론 ... 17
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 17
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 17
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 21
• 제 1 절 국내·외 관련기술의 현황과 문제점 ... 21
• 제 2 절 연구개발 전망 ... 22
• 제 3 절 기술도입의 타당성 ... 22
• 제 3 장 연구내용 및 결과 ... 24
• 제 1 절 느티나무 추출성분 분리 및 유효물질 구조 동정 ... 24
• 1. 카달겐 추출 ... 24
• 가. 공시재료 ... 24
• 나. 에탄올 추출 ... 24
• 다. HPLC 분석 ... 26
• 라. 카달렌 정량분석용 검량산 작성 ... 26
• 마. 기기분석 ... 28
• 2. 느티나무 에탄을 조추출액의 항균 활성 검정 ... 28
• 가. 공시균주 ... 28
• 나. 항균활성 검정 ... 28
• 3. 카달렌의 생리활성 검정 ... 29
• 가. Hydroxy radocal·소거활성 측정 ... 29
• 나. Superoxide radical 소거활성 측정 ... 30
• 다. 멜라닌 미백효과 측정 ... 30
• 라. MTT assay에 의한 카달렌의 세포생존율 평가 ... 30
• 마. Esterase 저해능 측정 ... 31
• 바. 카달렌에 의한 글루코오스 대사 억제 실험 ... 31
• 4. 느티나무 연륜별 카달렌의 분포 ... 32
• 가. 시료 제조 ... 32
• 나. 카달렌 추출 ... 32
• 다. 느티나무 연륜별 헥산 농축액의 HPLC 분석 ... 32
• 5. 느릅나무과 수종에서 카달렌 및 카달렌 동족체 분리 ... 33
• 가. 공시재료 ... 33
• 나. 에탄롤 추출 ... 33
• 다. HPLC 분석 ... 33
• 라. 기기분석 ... 34
• 6. 카달렌의 유도체 합성 및 활성 조사 ... 34
• 가. 시약 ... 34
• 나. 7-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxycadalene 의 합성 ... 34
• 다. 7-O-β-D-Cellobiosyl-3-methoxycadalene 합성 ... 37
• 라. HPLC 분석 ... 40
• 마. 기기분석 ... 41
• 바. 카달렌 유도체의 세포독성 평가 ... 41
• 제 2 절 세포주기 조절억제에 의한 폐암예방 및 치료제 개발 ... 42
• 1. 세포주기 검정 ... 42
• 가. Flowcytometric analysis ... 42
• 나. G1, G2/M checkpoint 및 protein trtanslation에 미치는 영향 ... 42
• 1) 시료준비 ... 42
• 2) 단백질 정량 ... 42
• 3) Western blotting ... 43
• 2. 카달렌이 protein translation에 미치는 메커니즘 ... 43
• 가. 시료 준비 ... 43
• 나. 단백질 정량 ... 43
• 다. Western blot ... 44
• 라. Kinase assay ... 44
• 마. Immunocytochemistry ... 44
• 제 3 절 생체내 안정성 평가 ... 46
• 1. 단회투여 독성 시험평가 ... 46
• 가. 연구수행 방법 ... 46
• 1) 실험동물 및 사육조건 ... 46
• 2) 시험군의 구성 및 용량설정 ... 46
• 3) 투여약액의 조제 및 투여방법 ... 47
• 나. 관찰 및 검사항목 ... 47
• 1) 일반증상 관찰 ... 47
• 2) 체중 측정 ... 47
• 3) 부검 ... 47
• 4) 통계학적 분석 ... 47
• 2. 반복투여 독성 시험평가 ... 48
• 가. 연구수행 방법 ... 48
• 1) 실험조건 및 사육조건 ... 48
• 2) 시험군의 구성 및 용량설정 ... 48
• 3) 투여약액의 조제 및 투여방법 ... 49
• 나. 관찰 및 검사항목 ... 49
• 1) 일반증상관찰 ... 49
• 2) 체중측정 ... 49
• 3) 부검 ... 49
• 4) 병리학적 검사 ... 50
• 제 4 절 결과 및 고찰 ... 52
• 1. 느티나무 추출성분 분리 및 유효물질 구조 동정 ... 52
• 가. 느티나무에서 카달렌의 생합성과정 ... 54
• 나. 카달렌 분리 및 구조동정 ... 56
• 다. 느티나무 연륜별 카달렌의 분포조사 ... 60
• 라. 느티나무 에탄올 조추출액의 항균활성 검정 ... 64
• 마. 느티나무 에탄을 조추출액의 항산화활성 ... 66
• 바. 카달렌의 생리활성 검정 ... 67
• 1) Superoxide radical과 hydroxy radical 소거활성 측정 ... 67
• 2) 세포독성 및 멜라닌 미백효과 측정 ... 69
• 사. 느티나무 심재부에서 단리한 카달렌 동족체 구조동정 ... 76
• 1) 화합물 3,7-Dimethoxycadalene 구조 ... 77
• 2) 화합물 7-Hydroxycadalene-5,8-quinone 구조 ... 80
• 3) 화합물 3,10-Cadinadiene 구조 ... 82
• 4) 그 외 화합물 ... 84
• 아. 느릅나무과 수종에서 카달렌 및 카달렌 동족체 분리 ... 88
• 1) 느릅나무(Ulmus davidiana Planch.) ... 91
• 2) 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.) ... 92
• 3) 당느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance.) ... 93
• 4) 큰잎느릅나무((Ulmus macrophylla Nak.) ... 95
• 자. 카달렌-글루코사이드의 세포독성 측정 ... 97
• 2. 세포조절주기 억제에 의한 폐암예방 및 치료제 개발 ... 103
• 가. 카달렌의 적용용량 및 시간 ... 103
• 나. 세포주기 검정 ... 103
• 다. G1, G2/M checkpoint에 미치는 영향 ... 105
• 라. Protein translation 및 세포 신호전달에 미치는 영향 ... 109
• 3. 생체내 안전성 평가 ... 113
• 가. 단회투여 독성 시험평가 연구 ... 113
• 1) 사망동물 및 임상증상 관찰 ... 113
• 2) 체중변화 ... 113
• 3) 육안적 부검 소견 ... 113
• 나. 반복투여 독성 시험평가 연구 ... 116
• 1) 사망동물 및 임상증상 관찰 ... 116
• 2) 체중변화 ... 116
• 3) 혈액 및 혈액 생화학적 검사 ... 118
• 4) 병리조직학적 검사 ... 118
• 제 5 절 결론 ... 127
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 133
• 제 1 절 연구개발의 목표와 내용 ... 133
• 제 2 절 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 133
• 제 3 절 연구추진 내용 및 계획 ... 134
• 제 4 절 연구결과의 관련분야 기여도 ... 135
• 제 5 장 연구개발 결과의 활용계획 ... 137
• 제 6 장 참고문헌 ... 138
• 끝페이지 ... 146