초록 ▼

○ 연구결과
홍화의 골강화 기능을 세포게와 동물실험계로 평가 하였다. 홍화의 골세포증식효과는 인간유사세포계를 이용하여 비교하였으며 골 활성의 지표로서 Alkaline phosphatase(ALP) 활성은 대조구 대비 최고 30% 이상 활성을 보였다. 홍화추출물은 조골활성 및 파골억제 특성을 모두 나타냈으며 RANKL과 OPG의 상호작용보다는 multinucleate cell의 분화에 대한 억제활성이 보다 높은 것으로 검색되었다. 국산홍화는 품종차이 및 토질 등 재배환경의 차이가 있는 외래산과 비교하여 독성이 낮을뿐 만 아니라

○ 연구결과
홍화의 골강화 기능을 세포게와 동물실험계로 평가 하였다. 홍화의 골세포증식효과는 인간유사세포계를 이용하여 비교하였으며 골 활성의 지표로서 Alkaline phosphatase(ALP) 활성은 대조구 대비 최고 30% 이상 활성을 보였다. 홍화추출물은 조골활성 및 파골억제 특성을 모두 나타냈으며 RANKL과 OPG의 상호작용보다는 multinucleate cell의 분화에 대한 억제활성이 보다 높은 것으로 검색되었다. 국산홍화는 품종차이 및 토질 등 재배환경의 차이가 있는 외래산과 비교하여 독성이 낮을뿐 만 아니라 세포 증식 효과도 상대적으로 다소 우수하였고 세포증식능이 농도 증가에도 지속적으로 유지되는 것으로 나타났다. 홍화의 골관련 유전자에 대한 영향은 PTH Receptor, Protein Kinase A, C prostacyclin synthase, collagen type IV 유전자 발현을 현저히 증가시켰으며 calcitonin Receptor, phospholipase A₂, COX, Prostaglandin E₂ synthase 유전자 발현을 현저히 억제하였다. 골강화 활성을 교차검증하기 위하여 Bone matrix 형성과 관련해서는 수평아리 시험계를, 여성호르몬 변화와 관련해서는 난소절제쥐 모델을 활용하였다. 홍화시료는 간, 신장, 당 대사에서 독성을 나타내지 않았으며 골강도를 증가시켰고 Bone matrix와 Bone mineral 형성에 도움을 주는 것으로 나타났다. 홍화 골세포 활성추출물은 온도 및 pH 변화에서 비교적 활성이 유지되어 체내 및가공시 활성성분의 작용 가능성을 시사하였다. 홍화의 골강화 핵심성분을 분리, 정제하여 동정한 경우 lignan 화합물의 일종인 tracheloside 및 N-(p-coumaroyl)serotonin mono-β-D-glucopyranoside로 밝혀졌다. 홍화의 가공소재화를 위하여 산화안정을 위하여는 TBHQ와 Tocopherol이 효과적이었으며, 유화성으로는 자당지방산 에스테르가 효과적이었다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results and Recommendation
Korean Carthamus tinctorius extract for prevention of osteoporosis was conducted on human-like osteoblast, osteoclast cell and animal model system. The extract activate human-like osteoblast cell proliferation suggesting safe from cell cytotoxicity. Alkaline phosphat

Ⅳ. Results and Recommendation
Korean Carthamus tinctorius extract for prevention of osteoporosis was conducted on human-like osteoblast, osteoclast cell and animal model system. The extract activate human-like osteoblast cell proliferation suggesting safe from cell cytotoxicity. Alkaline phosphatase activity as a marker of osteoblast cell proliferation was 40% higher than that of control. Dose-response of ALP activity shows the activity increase as sample concentration increase till 10^-1mg/ml. The extract inhibited differentiation of osteoclast cell precursor and multinucleate cell ranging 80%-90% compared to control. The extract is stable on temperature variation and keep the high activity compared to control till 6 minutes of sample heating. The activity shows 20% higher than control at various pH. It suggest that activity of the base is able to stable on change of temperature and pH during processing or absorption in human body.
The extract stimulated expression of PTH Receptor, Protein Kinase A, C prostacyclin synthase, collagen type IV genes, and inhibit expression of calcitonin Receptor, phospholipase A₂, COX, Prostaglandin E₂ synthase genes. Male model have been chosen as bone matrix development, compared to female model of ovariectomized rat as hormone metabolism in animal test. Korean Carthamus tinctorius extract showed no cytotoxicity on liver and kidney from ALT, AST, GGT liver factor, and from urea, creatinine, blood glucose of kidney factor. Immunoprotein or enzyme may active for bone turn over as total protein was higher than control. Low value of triglyceride of the extract was due to feed of plant. Alkaline phosphate activity, phosphate content in serum, and bone strength, stiffness suggest Carthamus tinctorius was effective on bone mineralization. Active compound is identified to tracheloside within lignan compound and N-(p-coumaroyl)serotonin mono-β-D-glucopyranoside.
Antioxidants was effective to TBHQ, Tocopherol, and emulsifier was effective to fatty acid ester for commercial product. The material will be studied on metabolism and clinical experiment, then developed health supplement of quality controlled product to market.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 16
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 23
• 1. 연구의 목적 ... 23
• 2. 연구개발의 필요성 ... 23
• 3. 연구범위 ... 25
• 4. 앞으로 전망 ... 25
• 5. 기술도입의 타당성 ... 26
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 27
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 28
• 제3-1장 연구개발수행내용 ... 28
• 제1절 시료의 용매 추출 및 농축 ... 28
• 1. 국산시료 확보 및 활성성분추출 ... 28
• 2. 세포시험용 검액 제조 ... 28
• 3. 동물시험용 추출물 제조 ... 28
• 제2절 세포계 골강화 활성 시스템 및 검색 ... 30
• 1. 조골세포의 세포증식 실험 ... 30
• 1.1. 조골 세포의 선별 및 세포배양 ... 30
• 1.2 골세포의 생존능 측정 ... 30
• 1.3 조골세포에서의 Alkaline phosphatase(ALP) 활성 측정 ... 30
• 2. 파골세포의 증식억제효과 ... 31
• 2.1 세포배양 ... 31
• 2.2. Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) staining ... 32
• 제3절 활성성분의 세포내 유전자 발현 특성 ... 32
• 1. 시료 제조 ... 32
• 2. 조골세포의 유전자발현에 미치는 영향 ... 32
• 2.1 MG-63 Cell의 배양 ... 32
• 2.2 tRNA(total RNA) 분리 ... 33
• 2.3. cDNA 제조 ... 33
• 2.4. cDNA의 정제 ... 34
• 2.5. 유전자 발현의 확인 및 정량 ... 34
• 3. Protein Kinase 측정 ... 34
• 3.1. Protein Kinase C 활성 측정 ... 34
• 3.2. Protein Kinase A 활성 측정 ... 35
• 4. 통계처리 ... 35
• 제4절 동물계 골강화 활성 시스템 구축 ... 36
• 1. 수평아리를 활용한 골다공증 억제 효과 ... 36
• 1.1. 실험설계 및 실험사료의 급여 ... 36
• 1.2. 병아리 사료 배합표 ... 37
• 1.3. 실험동물 및 사양관리 ... 38
• 2. 난소절제한 암컷 쥐의 골다공증 억제 실험 ... 38
• 2.1. 실험동물 ... 38
• 2.2. 난소척출(ovarietomy) ... 39
• 2.3. 실험설계 및 실험사료의 급여 ... 39
• 제5절 홍화의 동물시험계 골강화 활성 검색 ... 40
• 1. 병아리 해부 및 생체부위 분리 ... 40
• 2. 난소적출한 쥐의 해부 및 생체부위 분리 ... 40
• 3. 생화학적 분석 ... 40
• 3.1. 혈액내 inorganic P, total Ca 및 ALP 측정 ... 40
• 3.2. Inorganic P의 분석 ... 41
• 3.3 Total Ca의 분석 ... 41
• 3.4. ALP activity의 분석 ... 41
• 4. 실험동물 사육시 증체량, 사료섭취량 및 식이효율 ... 41
• 5. 골강도의 물리적 특성 분석 ... 42
• 6. 통계처리 ... 42
• 제6절 활성성분의 분리 및 물질 특성 ... 43
• 1. 시약 ... 43
• 2. 기기 ... 43
• 3. 실험방법 ... 43
• 3.1. 용매 분획 ... 43
• 3.2. 시약 제조 방법 ... 44
• 3.3. TLC를 이용한 주요물질 정성분석 ... 44
• 4. 활성성분의 분리 및 정제 ... 45
• 4.1. 기기 및 시약 ... 45
• 4.2. 홍화로부터 활성물질의 분리, 정제 ... 46
• 제7절 골강화 성분의 이화학적 특성 ... 46
• 제8절 활성성분의 초임계 추출방법 ... 47
• 제9절 발골시료의 무기질 분석 ... 49
• 제10절 활성추출물의 산화안정성 ... 50
• 1. 시료 ... 50
• 2. 활성추출물 ... 50
• 3. 자동산화에 의한 홍화유의 산화안정성 측정 ... 51
• 3.1. 과산화물가 ... 51
• 3.2. 산가 ... 51
• 제11절 활성성분의 소재화 활용기술 ... 52
• 1. 골강화 활성성분의 수용액내 분산 ... 52
• 2. 유화제의 선정 ... 52
• 3. 분산도의 측정 ... 52
• 제3-2장 연구개발 수행 결과 ... 53
• 제1절 시료의 용매 추출 및 농축 ... 53
• 1. 토종홍화와 외산(중국산) 홍화 비교 ... 53
• 2. 원료의 추출수율 및 성분특성 ... 53
• 2.1. 시료의 농축 수율 및 농도 ... 53
• 2.2. 시료의 성분특성 ... 54
• 제2절 세포계 골강화 활성 시스템 및 검색 ... 55
• 1. 골 활성 세포계 시험법의 구축 및 골강화 활성 검색 ... 55
• 1.1. 골관계 시험법의 구축 ... 55
• 1.2. 골강화 활성 검색 ... 55
• 2. Calvarial cell에 의한 홍화시료의 독성 및 조골활성 시험 ... 61
• 2.1. 골세포의 증식능 측정 ... 62
• 2.2. Collagen 합성량 측정 ... 62
• 3. 파골세포 억제활성 ... 63
• 제3절 활성성분의 세포내 유전자 발현 특성 ... 64
• 1. Vitamin D3 수용체의 발현에 미치는 영향 ... 64
• 2. PTH receptor 유전자 발현에 미치는 영향 ... 65
• 3. Calcitonin 수용체 유전자 발현에 미치는 영향 ... 66
• 4. PKA(Protein Kinase A) 유전자 발현에 미치는 영향 ... 66
• 5. PKC(Protein Kinase C) 유전자 발현에 미치는 영향 ... 67
• 6. PLA2 (phospholipase A2) 유전자 발현에 미치는 영향 ... 68
• 7. COX (cyclooxygenase) 유전자 발현에 미치는 영향 ... 69
• 8. PGE2 (Prostaglandin E2) synthase 유전자 발현에 미치는 영향 ... 70
• 9. Prostacyclin synthase 유전자 발현에 미치는 영향 ... 71
• 10. Collagen 유전자 발현에 미치는 영향 ... 72
• 11. 유전자에 대한 영향의 해석 ... 73
• 제4절 동물계 골강화 활성 시스템 구축 ... 75
• 1. 동물계 골강화 활성 시스템 구축 ... 75
• 1.1. 동물계 골강화 활성 시스템 구축 ... 75
• 1.2. 수평아리를 활용한 시험계의 구축 ... 75
• 1.3. 난소절제 흰쥐를 활용한 시험계의 구축 ... 76
• 제5절 홍화의 동물시험계 골강화 활성 검색 ... 76
• 1. 저칼슘 식이 수평아리 시험계에서 홍화의 골강화 효과 ... 76
• 1.1. 체중 변화 ... 76
• 1.2. 경골의 길이, 두께 및 무게 ... 77
• 1.3. 경골의 breaking strength, max. displacement, elastic stiffness 및 total stiffness ... 78
• 1.4. 수평아리의 혈액 지표인자 분석 ... 79
• 2. 난소적출 실험쥐에서 홍화의 골강화 효과 ... 83
• 2.1. 체중의 변화 ... 83
• 2.2. 장기무게 ... 84
• 2.3. 경골의 성장상태 측정 ... 85
• 2.4. 난소절제 흰쥐의 혈액 지표인자 분석 ... 86
• 제6절 골강화 성분의 이화학적 특성 ... 91
• 1. 농도활성 관계 (dose-response) ... 91
• 2. 온도에 따른 골세포 활성화 변화 ... 92
• 2.1. 가열온도의 영향 ... 92
• 2.2. 가열시간의 영향 ... 94
• 3. pH에 따른 골세포 활성화 변화 ... 95
• 4. 세포내 작용특성 ... 96
• 제7절 활성성분의 분리 및 물질 특성 ... 97
• 1. 시료의 용매분리 및 성분특성 ... 97
• 1.1. 분획물의 수율 ... 97
• 1.2. TLC를 이용한 주요물질 검정 ... 97
• 2. 골강화 활성성분의 분리 ... 98
• 2.1. 홍화의 골강화 활성성분의 용매분획 ... 98
• 2.2. 용매분획물의 column chromatography ... 100
• 2.3. 분리물의 정성분석 ... 104
• 3. 홍화종자로부터 활성물질의 분리, 동정 ... 105
• 3.1. 화합물 1의 구조 ... 105
• 3.2. 화합물 2의 구조 ... 107
• 4. 활성성분의 수율 ... 113
• 제8절 활성성분의 초임계 추출 ... 114
• 1. 활성성분의 초임계 추출 ... 114
• 2. 지방산의 분석 ... 114
• 3. 인지질 함량분석 ... 115
• 제9절 활성추출물의 산화안정성 ... 116
• 1. 자동산화에 의한 홍화유의 산화안정성 ... 116
• 1.1 항산화제 처리와 과산화물가 변화 ... 117
• 1.2 항산화제 처리와 산가변화 ... 118
• 제10절 활성성분의 소재화 활용기술 ... 120
• 1. 홍화 소재의 골강화 제품화를 위한 Formulation ... 120
• 2. 액상 제품 개발을 위한 골강화 활성성분의 수용액내 분산 ... 120
• 2.1. 홍화의 경우 유지함량이 높은 등의 이유로 액상제품 개발이 없었다 ... 120
• 2.2. 분산도의 측정 ... 121
• 3. 분말, 환 등 고형제품의 개발 ... 123
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 126
• 1. 골강화 활성 시스템 구축 ... 126
• 2. 홍화의 골강화 활성 검색 ... 126
• 3. 국산 및 외산 비교 및 활성성분 추출 ... 126
• 4. 홍화 골강화 성분의 이화학적 특성 및 가공특성 ... 127
• 5. 연구 성과물 ... 127
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 128
• 1. 기술적 측면 ... 128
• 2. 경제.산업적 측면 ... 128
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 129
• 제7장 참고문헌 ... 136
• 끝페이지 ... 144