초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구 개발의 결과는 다음과 같다. 1차년도에는 기 발굴된 2종의 단백질 발현 증강인자를 이용한 애기장대 형질전환 식물체를 이용하여 증강인자의 효능을 검증하였다. Deletion, substitution, insertion 등의 방법으로 20종의 단백질 발현 증강인자 변이체를 제조하여 transient assay로 효능을 비교 분석하였다. 또한, 세포내 소기관 (엽록체, ER 및 저장액포)으로의 이동신호를 확보하고 기능을 transient expression으로 확인하였다.
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Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구 개발의 결과는 다음과 같다. 1차년도에는 기 발굴된 2종의 단백질 발현 증강인자를 이용한 애기장대 형질전환 식물체를 이용하여 증강인자의 효능을 검증하였다. Deletion, substitution, insertion 등의 방법으로 20종의 단백질 발현 증강인자 변이체를 제조하여 transient assay로 효능을 비교 분석하였다. 또한, 세포내 소기관 (엽록체, ER 및 저장액포)으로의 이동신호를 확보하고 기능을 transient expression으로 확인하였다.
제 2차년도에는 형질전환된 식물체 생성 및 transient assay를 이용한 세포내 소기관 발굴 및 단백질 발현 증강인자의 효능을 확인하였다. 소기관별 단백질 발현을 비교 분석하였을 때 엽록체의 stroma, thylakoid lumen, 및 퍼록시좀에서 발현이 높게 나타났다. 이들과 단백질 발현 증강인자를 연결하여 transient assay를 실시하였을 때 증강인자를 포함한 경우 발현이 증강되었으며, 이들을 이용한 형질전환식물체를 생산하였다.
제 3차년도에는 단백질 발현 증강 인자 (변이체 포함)와 단백질 이동 신호를 이용하여 형질전환용 벡터의 제작하고, 이를 이용한 형질전환 애기장대 및 담배 식물 생산하였다. 단백질 발현 증강인자와 단백질 이동신호를 이용하여 고효율 단백질 생산용 벡터 제작하고, 제조된 벡터를 이용하여 transient assay 실시하여 그 결과를 비교 분석하였다. 그 결과를 보면 담배 및 애기장대의 transient assay의 결과가 차이는 있었으나, 대체적으로 엽록체로 단백질을 저장하고 단백발현 증강인자를 사용하였을 때 단백질 발현이 증가되었다. 이러한 결과는 형질전환 담배에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, 식물체를 유용단백질을 생산하기 위한 bioreactor로 이용하기 위해서는 식물체에서 이종단백질을 대량으로 생산 할 수 있는 방법개발과 함께 생산된 단백질을 순수 분리할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 연구에서 개발한 단백질 발현 증강 인자 5종과 3종의 단백질 이동신호를 병합 사용한 고효율 발현 시스템에 대한 특허 출원을 의뢰 중에 있다. 확보된 지적 재산권은 향후의 고효율 형질전환용 벡터의 사업화와 기술거래를 통한 이익창출의 기반이 될 것이다. Dual-targeting을 이용하여 형질전환 식물체에서 이종단백질의 발현을 증가시키는 방법은 효율이 높은 새로운 방법이다. 이를 이용하여 식물에서 단백질을 생산하고자 하는 회사와 구체적인 단백질에 대한 공동개발이 가능하다.
또한 본 연구 결과를 토대로 산업용 및 의료용 단백질, interferon, EPO, NIa protease, phytase 등을 생산하는 형질전환체를 제작하여 그 생산성을 확인하고 생산된 단백질들의 기능성을 검증 한 후 특허를 출원하여 산업재산권을 확보한다. 또한 형질전환체에서 생산된 단백질에 대한 경제성을 미생물, 동물 배양 시스템과 비교, 분석하여 형질전환식물체의 bioreactor로서의 가능성을 판단하고 세대검정 및 안정성을 관찰한 후 산업화를 추진한다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results and application possiblities
Results obtained are as the followings. During the first year, we confirmed the efficiency of the 2 protein expression enhancers by using Arabidopsis transgenic plants. Protein expression derivatives were generated by making deletion, substitutuin and inser

Ⅳ. Results and application possiblities
Results obtained are as the followings. During the first year, we confirmed the efficiency of the 2 protein expression enhancers by using Arabidopsis transgenic plants. Protein expression derivatives were generated by making deletion, substitutuin and insertion mutations. And the efficiency of these derivatives were analysed by transient expression assay.
Translocation signals to subcelluar organelles such as chloroplasts, ER and storage vacuole were secured and the function of these translocation signals were confirmed.
During the second year, subcelluar organelle to store expressed foreign proteins were chosen by using expression level in transgenic plants and in protoplasts. Stroma of chloroplasts, thylakoid membrane and peroxisomes were good sources for foreign protein storage. These translocation signals were connected with protein expression enhancers, and then transient assay was performed to evaluate the efficiency of these systems. The enhancers indeed enhanced protein expression and transgenic plants containing these system were prepared.
During the third year, protein expression enhancers including derivatives and translocation signals were generated and these were used to produce transgenic Arabidopsis and tobaccos. Vectors for high level protein expression system were prepared and were compared each other by transient protein expression assay. There were some differences in protein expression patterns in Arabidopsis and tobacco. However, generally, protein expressions were increased when proteins were stored in chloroplasts in the presence of enhancers. Similar results were obtained with transgenic tobaccos. In order to use plants as bioreactors for useful protein production, forein protein purification methods also needed to be developed and this was done in subgroup III.
The protein expression system which combines both protein expression enhancers and translocation signals are submitted for patent application. This intellectual property (IP) will be a basis for commercialization of this system and profit creation through product development and licensing-out. The technology of foreign protein expression using dual-targeting vectors new to this field. Specific protein production projects and cooperation will be possible in conjuction with other companies.
In addition to this, trangenic plants which can produce industrial and medical proteins such as interferon, EPO, NIa protease, and phytase can be prepared. After the productivity and activity of the expressed proteins are evaluated, patent applications may be submitted. Economical efficiency of protein production using transgenic plants should be compared and analysed with those of microorganism and animal culture systems. Before, commercialization, the possibility of trangenic plants as bioreactors and stable production of proteins through generations need to be determined.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 11
• 목 차 ... 15
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 18
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 18
• 1. 연구 개발의 목적 ... 18
• 2. 연구 개발의 필요성 ... 19
• 3. 기술 보유 현황 ... 21
• 제 2 절 연구 개발의 범위 ... 22
• 1. 제 1단계 ... 22
• 2. 제2 단계 ... 23
• 3. 제 3 단계 ... 23
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 25
• 제 1 절 국내․외 기술개발현황 ... 25
• 제 2 절 본 연구 과제의 중요성 ... 27
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제 1절 연구 방법 및 연구 내용 ... 29
• 제 2 절 연구 결과 ... 32
• 1. 제 1차년도 연구결과 ... 32
• 가. 제 1세부과제 ... 32
• 1) 형질전환용 벡터제작 ... 32
• 2) 애기장대 형질전환체 생산 ... 33
• 3) Western blot analysis를 이용한 단백질 발현 분석 ... 34
• 나. 제 2 세부과제 ... 36
• 1) Transient assay용 벡터 제작 ... 36
• 2) 증강 효능 검증을 위한 Western blot analysis ... 41
• 다. 위탁과제 ... 44
• 1) 단백질발현 증강인자의 발현증가 기작 ... 44
• 2) 세포 소기관 targeting용 발현 벡터 제작 ... 45
• 가) Chloroplast targeting 용 발현 벡터 ... 46
• 나) Dual targeting용 발현 벡터 ... 48
• 다) ER 및 저장액포용 발현 벡터 ... 48
• 2. 제 2차년도 연구결과 ... 52
• 가. 제 1 세부과제 ... 52
• 1) Transfection용 vector의 제작 ... 52
• 2) 형질전환 식물의 제조 ... 57
• 나. 제 2 세부과제 ... 58
• 1) 소기관별 단백질 발현정도 비교 ... 58
• 2) 1차년도에 발굴된 단백질 발현증강인자의 protoplast내 발현 ... 59
• 3) 단백질 발현증강인자와 세포내 소기관 이동신호를 이용한 단백질 발현 증강 효과 ... 61
• 다. 위탁과제 ... 64
• 1) 애기장대 원형질체에서 소기관별 발현양상 분석 ... 64
• 2) 형질전환 식물체에서 단백질 발현 증강인자 효과 검정 ... 67
• 3) 형질전환 애기장대 식물체에서 이종단백질의 소기관별 발현 및 축적 분석 ... 68
• 4) 단백질 발현증강인자에 의한 이종단백질 발현최적화를 위한 벡터 개량 ... 72
• 3. 제 3차년도 연구 결과 ... 73
• 가. 제 1 세부과제 ... 73
• 1) 형질전환 식물체의 제조 ... 73
• 2) 형질전환 식물체의 선별 및 배양 ... 73
• 3) 형질전환 식물체에서의 목적 단백질의 발현 ... 75
• 4) 제 2세대 형질전환식물체의 제작 ... 77
• 5) 형질전환 담배의 제작 ... 83
• 6) 사업화 추진현황 ... 87
• 나. 제 2 세부과제 ... 88
• 1) 담배를 이용한 증강인자의 단백질 발현 증강효과 분석 ... 88
• 2) 유용단백질 cloning ... 92
• 3) NIa protease에 대한 polyclonal antiserum의 제조 ... 96
• 4) 제조한 벡터를 이용한 transient expression assay ... 99
• 다. 위탁과제 ... 103
• 1) 단백질 순수 분리용 발현벡터 제조 ... 103
• 2) 엽록체의 순수분리 ... 104
• 3) 친화성 tag을 이용한 단백질 분리벡터 제조 ... 105
• 4) 엽록체 targeting용 TAP 벡터 ... 108
• 5) 형질전환 식물체에서의 이종단백질 발현 ... 110
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 113
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 116
• 제 1절 연구 결과의 기대효과 ... 116
• 제 2절 시장성 ... 116
• 제 3절 활용방안 ... 117
• 1. 단백질 발현 증강 인자 및 단백질 이동 신호 ... 117
• 2. 고효율 단백질 생산 형질전환 식물 ... 117
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 119
• 제 7 장 참고문헌 ... 121
• 끝페이지 ... 126