초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
천연물로부터 urease inhibitor의 효능을 가지는 물질을 분리하기 위하여 다양한 약 70여종의 식물로부터 5종의 가능성 있는 식물체를 선별하였다. 녹차엽에서 추출한 추출물이 다른 추출물에 비하여 높은 urease inhibitor의 활력을 보여 녹차엽 추출물을 가능성 있는 천연물 urease inhibitor로 선정하였다.
20여가지의 천연 발효물중 가능성 있는 5종의 발효물에서 미생물을 분리 동정하여 urease 생성 억제 미생물 균주를 선별하였다. 선발된 천연발효물에는

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
천연물로부터 urease inhibitor의 효능을 가지는 물질을 분리하기 위하여 다양한 약 70여종의 식물로부터 5종의 가능성 있는 식물체를 선별하였다. 녹차엽에서 추출한 추출물이 다른 추출물에 비하여 높은 urease inhibitor의 활력을 보여 녹차엽 추출물을 가능성 있는 천연물 urease inhibitor로 선정하였다.
20여가지의 천연 발효물중 가능성 있는 5종의 발효물에서 미생물을 분리 동정하여 urease 생성 억제 미생물 균주를 선별하였다. 선발된 천연발효물에는 yeast와 bacillus를 다량 함유 하고 있었는데, 그중 6종의 yeast를 분리 동정하고 API test를 통하여 확인하였다. 또한, 보유하고 있던 lactic acid bacteria로부터 가능성 있는 균주를 확인하고, 그것들을 비교하서 가장 우수한 균인 Candida krusei/inconspicua 204를 선별하였다.
천연물의 추출조건을 확립하기 위하여 열수와 천연물의 혼합 비율, 추출 시간, 추출 온도등에 따른 추출물의 활력과 양을 측정하여 최적의 추출 비율을 탐색하였다. 측정된 조건은 천연물의 양이 열수의 약 20%, 75℃에서 약 90분간 추출시 가장 높은 추출율을 보였다. 하지만, 활력을 고려하였을 경우 추출물의 획득 수율보다는 낮은 온도인 55℃정도에서 100분간 추출하는 것이 최대의 활력을 유지하면서 추출물을 얻을수 있는 조건으로 확인되었다.
선발된 미생물 균주 Candida krusei/inconspicua 204의 안전성을 검증하기 위하여 분자생물학적인 방법을 사용하여 균을 동정하였고, 일반적인 yeast 배지인 YM media보다 높은 수준의 glucose(12g/L)를 첨가하였을 경우 더 높은 성장을 확인하였다. 최대의 활력을 가지는 균주를 생산하기 위하여 urease inhibitor 활력을 배양 시간에 따라 측정하였다. 최적의 생장을 보이는 48시간 보다 더 오랜시간 (52시간)배양하는 것이 더 높은 수준의 활력을 확인할 수 있었고, 이는 yeast 자체의 urease inhibitor activity 보다는 그것들의 대사물질에 의한 효과인 것을 다시한번 확인해 주는 결과이다.
천연물 제제와 미생물 제제의 혼합 비율을 탐색하여 8:2로 하였을때 가장 높은 결과는 나타내었고, 이 복합제제의 열 안정성과 사료내 안정성을 확인하여 55℃, 7일까지는 안정성이 충분히 확보됨을 확인하였다.
복합 제제를 동물실험 이전에 사료내 혼합에 의한 안정성을 평가하였다. 사료의 보관은 실험실내의 상온이 아니라 실제 농장의 사료창고에 25kg 지대에 보관하였다. 먼저 복합 제제내의 미생물수는 18일경까지는 큰 변화가 없었다. 하지만 18일 이후부터는 살아있는 미생물의 수가 급격히 감소하였다. 또한, 사료내 혼합비율에 따라 다른 결과를 나았는데, 사료내 혼합 정도가 높을수록 18일 이후에 급격한 균수의 감소를 보인반면, 낮은 경우에는 큰 차이가 없었다. 첨가수준에 따른 활력은 균수와 비슷한 양상을 보였지만, 활력이 낮아지는 보관 기간은 균수보다는 늦었다. 약 20일 경부터 사료내 활력이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 28일 정도 보관하면 혼합 농도에 상관없이 0.2%, 0.5%, 1.0% 모두 비슷한 효과를 나타냈다. 사료내 0.2%, 0.5%, 1.0% 의 세 수준으로 복합 재재를 첨가하고, artificial slurry를 이용한 ammonia 발생 억제 정도를 측정하였다. 측정된 값은 1.0% 처리구에서 가장 높은 암모니아 억제를 보였다. 하지만, 인공 slurry의 보관기간이 15일 이상 되었을때는 1.0%에서 더 높은 암모니아 발생을 보였다.
복합화 제제의 열 안정성은 pelleting 시 받을수 있는 열처리 조건으로 실시하였다. 복합화 제제는 약 65℃까지는 안정성이 확보되어 있었지만, 75℃이상에서는 균수가 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 또한, pH에 따른 영향에서도 4와 6에서는 큰 변화가 없었지만, 2이하의 조건에서는 낮은 균수를 보인반면, urease inhibitor activity는 80%정도의 수준으로 높게 유지되고 있었다.
대량 생산시 신속한 평가방법을 구축하기 위하여 indophenol method와 phenol red method, 그리고 artificial slurry를 이용한 ammonia 발생량을 비교하였다.
indophenol method가 phenol red method에 비하여 높은 결과를 보였고, 첨가량이 높아질 수록 두 방법의 정확도는 감소하였다. 복합 재재의 효과를 검증하기 위해서는 복합제제의 농도가 10 ∼ 40mg/ml의 수준일 때 두 방법이 정확성이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 결과는 artificial slurry를 이용한 평가방법에서도 확인되었다.
본 연구에서 확인된 천연물 추출물과 미생물 제제는 비교적 높은 ammonia 발생 억제를 보였다. 하지만, 사료의 영양소 함량에 따라서는 낮은 ammonia 발생억제를 보이기도 하였다. 따라서, 본 연구의 결과를 바탕으로 사료내 단백질 수준에 따른 첨가제의 효과와 이에 따른 다른 가능성 있는 제제에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Abstract ▼

In order to fine and develop a urease inhibition-products from plants, many plant extracts was tested. Indophenol method, phenol red method, and ammonia emission from artificially slurry were conducted to select reliable plant extract. As a result, green tea extract was selected for urease inhibitor

In order to fine and develop a urease inhibition-products from plants, many plant extracts was tested. Indophenol method, phenol red method, and ammonia emission from artificially slurry were conducted to select reliable plant extract. As a result, green tea extract was selected for urease inhibitor.
Extraction condition was optimized to improve efficiency and efficacy. Basically, hot water was used. First, efficiency of extraction was ensured when extraction conditon was at 75℃ for 90 min. However, their urease inhibiting activity was diminished. Optimal extraction condition which could ensure the urease inhibiting activity was 55℃, and incubation time was 90 min, and ratio of green tea and water was 2:8.
Many strains of microbials were isolated from various sources. Among them, Candida krusei/inconspicua 204 showed better urease inhibiting activity. To optimize growth of microbials, Response Surface Methodology was used to develop a optimum medium. YM media, glucose, and pH were considered as a major factors for microbials and the composition of medium was determined for selected strains. Their growth was maximized in YM media supplemented with 12g/L glucose. Optimal growth condition was at 24℃ for 52 hours.
Urase inhibiting activity of green tea extract and Candida krusei/inconspicua 204 was investigated by indophenol method and phenol red method, and artificially slurry was also used to evaluate their effect on feces and urine. They were stored at room temperature for determining their heat stability, and they were heat treated to measure heat stability. They were stable upto 55℃, this temperature is similar that of pelleting. Their stability in room temperature was upto 7 day, afterward, their activity was steeply decreased.
Produced green tea extract and Candida krusei/inconspicua 204 were employed to evaluate urease inhibitory effect of pigs. Weaned pigs, pregnancy sows, and lactating sows was used. Supplementation of complex mixture of green tea extract and Candida krusei/inconspicua 204 reduced fecal and urinal ammonia emission, which was determined by using artificial slurry from each pigs. Different growth stage reflected on the effect of urease inhibitor activity of complex mixture of green tea extract and Candida krusei/inconspicua 204.
The complex mixture had a less effect on weaned pigs, lactating sows than pregnancy sows. this difference might be from the nutrient content of diet.
However, 0.5 % of complex mixture had a positive effect on ammonia production from artificial slurry.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 12
• 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 16
• 제1절 연구개발의 목적 ... 16
• 제2절 연구 개발의 필요성 ... 16
• 제1항 기술적 측면 ... 18
• 제2항 경제·산업적 측면 ... 20
• 제3항 사회문화적 측면 ... 21
• 제3절 연구 개발의 범위 ... 24
• 제1항 천연물, 미생물 urease inhibitor와 urease 생성 억제 미생물 균주의 선발 및 효능의 동물실험 검증 ... 24
• 제2항 선발 제제와 균주의 복합화 및 동물실험 검증 ... 24
• 제3항 신개발 제제의 현장적용실험 ... 25
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 26
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제1절 천연물, 미생물 urease inhibitor와 urease 생성 억제 미생물 균주의 선발 및 효능의 동물실험 검증 ... 29
• 제1항 실험재료 및 방법 ... 29
• 1. 천연물 확보 및 전처리 ... 29
• 2. 스크리닝 방법 ... 29
• 3. Urease 활성을 억제하는 천연물의 건조 및 분말화 ... 30
• 4. Urease 활성을 억제하는 천연물의 생산 최적화 ... 31
• 5. Urease 활성을 억제하는 천연물의 생산 ... 31
• 6. Urease 생성 억제 천연발효물의 획득 및 검색 ... 31
• 7. Urease 생성 억제 미생물 균주의 검색 및 선발 ... 32
• 8. Urease 생성 억제 probiotics의 검색 및 선발 ... 33
• 9. Urease 생성 억제 미생물 균주의 활력 검증 ... 34
• 10. Urease 생성 억제 미생물 균주의 urease inhibitor 효능 규명 ... 34
• 11. Urease 억제 미생물 균주의 urease inhibitor물질의 생산 최적화 ... 35
• 12. 미생물의 정제, 회수에 의한 microbial urease inhibitor 물질의 추출 ... 36
• 13. 천연물 추출 제제와 미생물 균주의 동물실험 검증 ... 37
• 14. 천연물 추출 제제와 미생물 균주의 slurry내 효과 검증 ... 40
• 제2항 실험결과 및 고찰 ... 41
• 1. Urease 활성을 억제하는 천연물의 1차 선별 ... 41
• 2. Urease 활성을 억제하는 천연물의 2차 선발 ... 45
• 3. Urease 활성을 억제하는 천연물의 건조 및 분말화 ... 46
• 4. Urease 활성을 억제하는 천연물의 생산 최적화 ... 49
• 5. Urease 생성 억제 천연발효물의 획득 및 검색 ... 50
• 6. Urease 생성 억제 미생물 균주의 검색 및 선발 ... 53
• 7. Urease 생성 억제 probiotics의 검색 및 선발 ... 55
• 8. Urease 생성 억제 미생물 균주의 활력 검증 ... 58
• 9. Urease 생성 억제 미생물 균주의 urease inhibitor 효능 규명 ... 60
• 10. Urease 억제 미생물 균주의 urease inhibitor 물질의 생산 최적화 ... 63
• 11. 천연물 추출 제제와 미생물 균주의 동물실험 검증 ... 63
• 12. 천연물 추출 제제와 미생물 균주의 slurry내 효과 검증 ... 65
• 제2절 선발 제제와 균주의 복합화 및 동물실험 검증 ... 69
• 제1항 실험재료 및 방법 ... 69
• 1. 천연물 추출물의 생산조건 확립 ... 69
• 2. 선발균주의 생산조건 확립 ... 71
• 3. 선발제제 및 추출물의 복합화 조건 확립 ... 79
• 4. 선발제제 및 균주의 건조 및 분말화 ... 79
• 5. 선발제제와 균주의 동물 실험 검증 ... 80
• 제2항 실험결과 및 고찰 ... 86
• 1. 천연물 추출물의 생산조건 확립 ... 86
• 2. 선발균주의 생산조건 확립 ... 93
• 3. 선발제제 및 추출물의 복합화 조건 확립 ... 107
• 4. 선발제제 및 균주의 건조 및 분말화 ... 110
• 5. 선발제제와 균주의 동물 실험 검증 ... 114
• 제3절 신개발 제제의 현장적용실험 ... 121
• 제1항 실험재료 및 방법 ... 121
• 1. 복합제제(미생물과 식물성 추출물)의 사료내 안정성 검증 ... 121
• 2. 복합제제(미생물과 식물성 추출물)의 분내 암모니아 발생 억제 효과 검증 ... 121
• 3. 복합제제(미생물과 식물성 추출물)의 열 안정성 검증 ... 121
• 4. 복합제제(미생물과 식물성 추출물)의 pH 변화에 따른 안정성 검증 ... 122
• 5. 대량 생산시 품질평가 관리 및 평가방법 구축 ... 122
• 6. 돼지의 사육 성적 및 번식성적 검증 ... 123
• 제2항 실험 결과 ... 129
• 1. 복합제제(미생물과 천연물 제제)의 사료내 안정성 검증 ... 129
• 2. 복합제제(미생물과 천연물 제제)의 분내 암모니아 발생 억제 효과 검증 ... 131
• 3. 복합제제(미생물과 천연물 제제)의 열 안정성 검증 ... 131
• 4. 복합제제(미생물과 천연물 제제)의 pH 변화에 따른 안정성 검증 ... 131
• 5. 대량 생산시 품질평가 관리 및 평가방법 구축 ... 135
• 6. Artificial slurry를 이용한 생산제제의 ammonia 발생 억제 효과 평가 방법 구축 ... 135
• 7. 돼지의 사육 성적 및 번식 성적 검증 ... 138
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 142
• 제1절 천연물, 미생물 urease inhibitor와 urease 생성 억제 미생물 균주의 선발 및 효능의 동물실험 검증 ... 142
• 제2절 선발 제제와 균주의 복합화 및 동물실험 검증 ... 143
• 제3절 선발 제제와 균주의 복합화 및 동물실험 검증 ... 145
• 제5장 연구개발 계획의 활용계획 ... 147
• 제1절 추가 연구의 필요성 ... 147
• 제2절 타 연구에의 응용 ... 147
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 148
• 제7장 참고문헌 ... 149
• 끝페이지 ... 151