초록

○ 연구결과
1. 가시오가피로부터 기능성 식품 첨가물 개발
2. 가시오가피 복합제의 면역조절에 의한 강장작용
3. 가시오가피 복합체의 항산화작용 및 보간작용
4. 알코올로 유도한 생쥐의 급성간손상과 만성간손상에 대한 GF-AS의 알코올 해독효과

Abstract ▼

Acanthopanax senticosus (A. senticosus), called the 'Siberian Ginseng' has been well known to be prophylactic for various diseases such as chronic bronchitis, hypertension and ischemia. A. senticosus is also known to be effective for reducing many kinds of stress or fatigue and so call it 'adatogen'

Acanthopanax senticosus (A. senticosus), called the 'Siberian Ginseng' has been well known to be prophylactic for various diseases such as chronic bronchitis, hypertension and ischemia. A. senticosus is also known to be effective for reducing many kinds of stress or fatigue and so call it 'adatogen'. In recent, Davydov et al. was well documented that the herb included various compounds such as acanthosides, eleutherosides, senticoside, triterpenic saponin, flavon, vitamins and minerals, and they are related to its diverse biological activities. Interestingly, many investigators demonstrated two contrary views on the immunomodulatory effect of A. senticosus: the stimulation and the suppression of immune responses. In fact, our data also showed that the crude extract of stem of the herb has the dual activities according to the method of extraction. These results raise a question which constituents related to each activity.
Antitumor and immunomodulatory activities of an aqueous extract (GF-1) of Acanthopanax senticosus was examined. In experimental lung metastasis of colon26-M3.1 carcinoma cells, intravenous (i.v.) administration of GF-1 2 days before tumor inoculation significantly inhibited lung metastasis in a dose-dependant manner. The i.v. administration of GF-1 also exhibited the therapeutic effect on tumor metastasis of colon26-M3.1 cells, when it was injected 1 day after tumor inoculation. In an in vitro cytotoxicity analysis, GF-1 at the concentration up to 1000 mg/ml did not affect the growth of colon26-M3.1 cells. In contrast, GF-1 enhanced the responsiveness to a mitogen, concanavalin A (ConA), of splenocytes in a dose-dependent manner. Peritoneal macrophage stimulated with GF-1 produced various cytokines such as IL-1β, TNF-α, IL-12 and IFN-g in an in vitro experiment. The macrophages obtained from the mice which were injected with GF-1 (500 mg) 3 gays before the assay showed significantly higher tumoricidal activity against tumor cells than that of the untreated macrophages. In addition, the i.v. administration of GF-1 significantly augmented NK cytotoxicity to Yac-1 cells. The depletion of NK cells by injection of rabbit anti-asialo GM1 serum completely abolished the inhibitory effect of GF-1 on lung metastasis of colon26-M3.1 cells. These data suggest that GF-1 has antitumor activity to inhibit tumor metastasis prophylactically as well as therapeutically, and its antitumor effect is associated with activation of macrophages and NK cells. To identify the immunostimulatory active molecuels in A. senticosus, we fractionated the crude proteins (GF-AS) from aqueous extract of A. senticosus and selected the glycoproteins (EN-SP) from GF-AS. To achieve anti-tumor activity, these samples were applied to experimental tumor metastasis model using colon26-M3.1 carcinoma or B16-BL6 melanoma cells in syngeneic mice, and analyzed the involvement of activation of NK cells and macrophages in its anti-metastatic effect against tumors.
Competitive direct ELISAwas carried out to establish quantitative analysis method of purified immuno-activating substance (EN-SP) from Acanthopanax senticosus (A. senticosus). Mouse antisera (anti-EN-SP) against EN-SP was generated by immunization (s.c.) of EN-SP purified from A. senticosus as an immunogen. The titer of anti-EN-SP was about 1:400, and the optimal dilution of EN-SP-HRP conjugate was 1:1000. When the standard curve was constructed by ELISA, its sensitivity was about 0.2 ㎍/㎖. The coefficient variations of intra- and interassay were 6.13~8.81% and 6.73~8.60% respectively. According to the standard curve, the concentration of EN-SP in various senticosus extracts and was only found to be 59.85 ㎍ in 10 mg of extract of the bark of A. senticosus. Similarly the immunostimulating activity to produce TNF-a or IL-12 among the various extracts of senticosus was shown to be correlation with the content of EN-SP. These results demonstrated that competitive ELISA is a convenient, fast, reproducible, and accurate method for the determination of EN-SP as a immunologically active standard substance in extract of A. senticosus.
Administration of boiled fraction of Acanthopanax senticosus (GF-2) prophylactically and therapeutically inhibited the systemic anaphylactic shock induced by compound 48/80 in mouse. GF-2 significantly inhibited the production of histamine and eosinophyl in serum from mouse by injection of compound 48/80 in a dose dependent manners. GF-2 does-dependently inhibited TNF-α production from peritoneal exudative cells activated by LPS. In addition, intraperitoneal injection of GF-1 suppressed the production of IgG1 and IgE antibody in mice immunized with a mixture of ovalbumin (OVA) and aluminium hydroxide (alum). These results indicated that GF-2 may be beneficial in the treatment of nonspecific and specific anaphylactic reaction and could be clinically applied in the treatment of allergic diseases.
Acanthopanax senticosus(A. senticosus) is a useful medicinal plant and have been used to promote robustness and as a remedy for many ailments including anti-blood-sugar duabetes, neuralgia, palsy, sex- and learning-behavior dufficulties, cancer and because of its antioxidant properties, it has been used to treat several stresses. We prepared aqueous extract GF-100 and GF-200 from Acanthopanax senticosus(A. senticosus) and GF-AS purified from GF-100 as a potent protein, which were revealed immune enhancing effects. We examined the hepatoprotective, antioxidative and alcohol detoxifying effect of GF-100, GF-200 and GF-AS in CCl4- or alcohol-induced hepatotoxicity animal model.
Hepatoprotective effect of an aqueous extract(GF-100 and GF-100) of Acanthopanax senticosus was examined. GOT, GPT, ALP and LDH activity were increased by CCl4 i.p. injection but its actitivity was reduced by GF-100 and GF-200. The adminstration of GF-100 and GF-200 also exhibited the hepatoprotective effect against alcohol-induced liver injury by lowering the level of the hepatic injury indices and lipid peroxidation.
Antioxidative activity of GF-100, GF-200 and GF-AS in vitro was evaluated by DPPH radical scavenging ability and by determining lipid peroxide(MDA).
The GF-100, GF-200 and GF-AS significantly increased DPPH scavenging activity and decreased MDA production. EC50 of scavenging DPPH radical was 6.8μg/ml compared with EC 9.8μg/ml. Antioxidative effect of GF-AS was similar to BHT as synthetic antioxidant. These results revealed strong antioxidant on the against scavenging on DPPH free radical and lipid peroxidative activity The antioxidative potency of GF-AS was similar BHA and may be effective against liver disease in which reactive oxygen species play a role as potent causative factors. We examined the inhibitory activities of GF-AS in acute carbon tetrachloride-induced liver injury in ICR mice. 1mg/kg BW of GF-AS adminstration was the most effective to prevent liver injury and ameliorated the increase in plasma GOT, GPT, LDH, bilirubin, glucose and TG, which is represent degree of liver injury. 0.5mg/kg BW of GF-AS and 5mg/kg BW of GF-AS also effective to prevent hepatic injury but 10mg/kg BW of GF-AS promoted liver injury as control. The effective dose of GF-AS revealed U shape curve from 1.0mg/kg BW. According to histochemical changes, severe hepatic lesions induced by CCl4 were reduced by the administration of the GF-AS, which were in good agreement with the results of the biochemical tests.
Catalase, SOD and GSH content were activated in the defense against oxidative cell injury by means of GF-AS being free radical scavengers. In present study, acute sublethal doses of CC4 reduced the activities of the GPx, GR and GSH and increased MDA content, whereas GF-AS reversed these effects. It is conceivable that the effect of GF-AS may be due initially to increases in hepatic antioxidative activities followed by reduction in hepatic peroxidative effects. SOD and catalase activities increased by GF-AS, suggesting that it can restore their enzyme activities or activate enzyme activity in CCl4-damaged liver tissue.
However, Treatment level of GF-AS is very important because GF-AS acted as an adaptogen. In this study, 1mg/kg BW in ICR mice is the most effective dosage to prevent CCl4-induced hepatotoxicity through antioxidative action We examined the inhibitory activities of GF-AS in chronic(SD rats) or acute(ICR mice) alcohol intake-induced liver injury. Because 1mg/kg BW of GF-AS adminstration was the most effective to prevent CCl4-induced liver injury, we treated 0.2, 0.5 and 1.0mg/kg BW in SD rats administered ethanol for 30days and 0.5, 1.0 and 2.5mg/kg BW in ICR mice adminsteded acute dosage of ethanol. In the chronic model, the level of GOT, GPT, LDH, bilirubin, r-GT, glucose, TG and albumin was significantly increased by adminstering ethanol.
There were significantly reduced in GOT and GPT by 0.5mg of GF-AS and in LDH by 0.2, 0.5 and 1.0mg of GF-AS. In the acute model, liver injury indices(GOT, GPT, Albumin, TG, Chol) were significantly decreased by GF-AS administration as a manner of dose-dependent, which was the most effective in 2.5mg GF-AS. Severe hepatic lesions induced by alcohol were reduced by the administration of the GF-AS. The level of GPx, GR and catalase was significantly reduced by adminstering ethanol and ite condition was not reversed by GF-AS supplementation. SOD and catalase activity was significantly increased in GF-AS supplemented group compared with control group. The co-administration of GF-AS with alcohol may release the toxicity of ethanol through antioxidative action but antioxidative effect of GF-AS was compensated by following long-term etahnol feeding. The activity of ADH, catalase, ALDH and MEOS did not change significantly GF-AS in chronic alcohol intake reflecting adaptation or injured liver tissue. In acute alcohol intake, plasma ethanol elearance was significantly increased by GF-AS i.p. injection as a manner of dose dependant and the most effective in 2.5mg GF-AS. ADH, ALDH and MEOS was increased by GF-AS supplementation but not consistant trends;
The effective dose of GF-AS was followed; ADH activity by 0.5mg GF-AS, ALDH activity by 2.5mg GF-AS, MEOS activity by 1.0mg GF-AS.
In conclusion, GF-AS would appear to contribute to alleviating the adverse effect of CCl4 and ethanol by enhancing antioxidant defense system and hepatoprotective and ethanol-detoxifying effect.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 18
• CONTENTS ... 23
• 목차 ... 25
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 31
• 제1절 연구개발의 목적 ... 31
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 31
• 제3절 연구개발의 범위 ... 34
• 1. 가시오가피로부터 조 추출법 확립 ... 34
• 2. 활성물질에 대한 기초연구 ... 35
• 3. 가시오가피의 면역 조절 작용 ... 36
• 5. 가시오가피의 보간기능의 조사 ... 39
• 7. 활성물질의 기능성 소재화 개발 ... 40
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 41
• 제1절 대상 기술 및 제품의 중요성 ... 41
• 제2절 국내외 개발현황 및 문제점과 전망 ... 41
• 1. 국내의 개발현황 ... 41
• 2. 국외의 개발 현황 ... 41
• 3. 문제점 ... 42
• 4. 전망 ... 42
• 5. 개발 대상 기술을 보유하는 국내, 외 회사의 현황 ... 42
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 43
• I. 제1세부과제 ; 가시오가피로부터 기능성 식품 첨가물 개발 ... 43
• 제1절 검색시료의 용매별 추출법에 따른 시료의 조제 ... 43
• 1. 가시오가피 추출물의 추출용매의 선정 ... 43
• 2. 면역자극활성을 가지는 4℃ 냉침추출법의 확립 ... 46
• 3. 4℃ 냉침추출의 in vitro 종양세포에 대한 세포독성 효과 ... 47
• 4. In vitro 정상세포에 대한 세포독성 ... 48
• 5. GF100에 대한 항체의 생산 ... 50
• 6. 항체에 의한 세포독성의 중화 실험 ... 51
• 7. 항체에 의한 cytokine의 유도 중화 실험 ... 51
• 8. 조 단백질 분획의 분리 및 Polyacrylamide Gel 전기영동 ... 54
• 9. Western blotting 실험 ... 54
• 10. 적혈구 응집반응(hemaagglutination) 실험 ... 55
• 11. 항체를 이용한 immunoaffinity column의 제조 및 물질의 분리 ... 56
• 12. Column chromatography에 의한 단백질(Protein-1과 Protein-2)의 분리 ... 58
• 13. 단백질(Protein-1과 Protein-2)의 생리활성의 확인 ... 60
• 14. EN-SP를 구성하는 단백질 및 다당류 분석 ... 60
• 15. EN-SP 성분의 단백질 특성의 조사 ... 64
• 16. EN-SP 성분의 다당류 특성의 조사 ... 64
• 17. EN-SP의 활성부위의 규명 ... 65
• 18. EN-SP의 면역세포에 대한 세포독성 혹은 증식에 미치는 영향 ... 67
• 19. Macrophage로부터 cytokines의 유도분비 조사 ... 69
• 20. Anti-GF-SP로부터 IgG 분획의 분리 ... 69
• 21. EN-SP에 대한 항체의 적정곡선 (Titration curve) ... 72
• 22. HRP-conjugate의 농도 결정 ... 72
• 23. Blocking buffer의 결정 ... 73
• 24. EN-SP에 대한 표준곡선의 작성 및 EN-SP 농도의 측정 ... 75
• 25. 반복성 및 회수율 조사 ... 76
• 26. 가시오가피 내의 각 부분의 EN-SP의 함량 비교 ... 79
• 27. 가시오가피와 오가피에 의한 macrophage로부터 cytokines의 유도활성 비교 ... 81
• 28. 활성물질의 기능성 소재화 개발 ... 83
• II. 제2세부과제 ; 가시오가피 복합제의 면역조절에 의한 강장작용 ... 84
• 제1절 면역억제작용 ... 85
• 1. Compound 48/80의존 전신성 anaphylactic 반응에서 GF-2의 효과 ... 85
• 2. Histamine 유리실험 ... 88
• 3. 혈중 호산구(eosinophil)의 함량 측정 ... 88
• 4. 복강세포로부터 TNF-α의 측정 ... 90
• 5. IgG1 및 IgE 항체가 측정 ... 92
• 6. EN-P 성분의 전신성 anaphylactic shock에 미치는 효과 ... 94
• 7. GF-P의 염증성 cytokine의 생산에 미치는 영향 ... 94
• 8. 항원에 대한 IgE의 생산 양식 ... 96
• 제2절 가시오가피의 면역자극 활성 ... 99
• 1. 냉침 추출물의 종양전이 예방활성 ... 99
• 2. 가시오가피 냉침 추출물의 종양전이 치료효과 ... 99
• 3. Macrophages 자극에 의한 cytokines의 유도 ... 101
• 4. 시료가 투여된 마우스의 macrophage에 의한 종양세포 살해 활성 ... 103
• 5. NK-cell 활성화에 미치는 효과 ... 103
• 6. NK-cell이 제거된 마우스의 시료에 의한 종양전이 억제 활성 ... 105
• 7. 가시오가피의 추출조건에 따르는 암전이 억제효과의 유도 ... 105
• 8. GF-AS 혹은 EN-SP의 Tumor metastasis에 미치는 효과의 조사 ... 106
• 9. 시료의 투여에 의한 종양 및 면역관련 세포에 미치는 영향 ... 109
• 10. Macrophage의 활성화에 의한 항종양전이 억제 효과의 측정 ... 112
• 11. 시료 자극된 macrophage의 이식이 암전이에 미치는 영향 ... 114
• 12. EN-SP 분획의 NK-cell 활성화 측정 ... 114
• 13. NK-cell deleted mouse에서의 종양전이 억제활성 ... 116
• 14. 담암숙주의 시료에 의한 연명율 조사 ... 119
• 15. Cisplatin에 의한 종양전이 억제효과에서 EN-3의 상승작용 ... 121
• 16. 경구투여에 의한 종양전이 억제효과 ... 122
• 17. 경구투여에 의한 비장세포의 종양 특이적인 cytokine의 유도 ... 124
• III. 제3세부과제 ; 가시오가피 복합제의 항산화작용 및 보간작용 ... 127
• 제1장 : 가시오가피 복합제의 항산화작용 및 보간작용의 방법 ... 127
• 1. 사염화탄소로 유발된 흰쥐의 급성 간독성에 미치는 가시오가피의 보간 효과 ... 127
• 2. 장기 알콜 투여로 유발된 흰쥐의 간손상에 미치는 가시오가피의 보간 효과 ... 129
• 3. GF-100과 GF-200 및 GF-AS의 in vitro 상에서의 항산화작용 ... 130
• 4. 사염화탄소로 급성간손상이 유도된 생쥐에서 GF-AS의 보간 및 항산화효과 ... 132
• 5. Ethanol로 유도한 흰쥐의 급성 또는 만성적인 간손상에 미치는 GF-AS의 보간효과와 알코올 해독작용 및 항산화효과 ... 136
• 6. 생화학적 분석 ... 138
• 7. 통계처리 ... 145
• 제2장 가시오가피 복합제의 항산화작용 및 보간작용 ... 145
• 제1절 사염화탄소로 유발된 흰쥐의 급성 간독성에 미치는 가시오가피 복합제의 보간 효과 ... 145
• 1. 혈청내 GOT 및 GPT 활성 ... 145
• 2. 혈청내 ALP 활성 ... 147
• 3. 혈청내 LDH 활성 ... 147
• 제2절 장기 알콜 투여로 유발된 흰쥐의 간손상에 미치는 가시오가피 복합제의 보간 효과 ... 149
• 1. 장기무게와 체중의 변화 ... 149
• 2. 혈장지질대사 ... 149
• 3. 혈청중의 간기능 지표효소 활성 ... 150
• 4. 과산화지질 활성 ... 152
• 제3장 가시오가피복합체(GF-100, GF-200)와 가시오가피 분획(GF-AS)의 in vitro 상에서의 항산화작용 ... 153
• 1. DPPH Free Radical Scavenger Activity에 의한 항산화 활성 ... 153
• 2. TBA법에 의한 지질과산화도 측정 ... 154
• 제4장 사염화탄소로 유도한 생쥐의 급성간손상에 대한 GF-AS의 보간효과 및 항산화효과 ... 156
• 제1절 사염화탄소로 유도한 급성간손상에 대한 GF-AS의 보간효과 ... 156
• 1. 혈장 GOT와 GPT ... 156
• 2. 혈장 Lactate dehydrogenase(LDH)의 활성 ... 159
• 3. 혈장 Albumin ... 160
• 4. 혈장 Glucose ... 162
• 5. 혈장 Triglyceride(TG) ... 162
• 6. 혈장 Cholesterol(Chol) ... 163
• 7. 간의 조직학적 소견 ... 164
• 제2절 사염화탄소로 유도한 급성간손상에 대한 항산화효과 ... 171
• 1. Superoxide dismutase(SOD)의 활성 ... 171
• 2. Glutathione Peroxidase(GPx)의 활성 ... 171
• 3. Glutathione Reductase(GR)의 활성 ... 173
• 4. Catalase의 활성 ... 174
• 5. Glutathione(GSH)의 함량 ... 177
• 6. Malondialdehyde(MDA)의 생성 ... 178
• 제4장 알코올로 유도한 SD Rat의 급성간손상과 만성간손상에 대한 GF-AS의 보간효과 와 알코올 해독효과 및 항산화효과 ... 180
• 제1절 알코올로 유도한 급성 또는 만성간손상에 대한 GF-AS의 보간효과 ... 180
• 1. 체중의 변화 ... 180
• 2. 혈장 GOT와 GPT 활성 ... 181
• 3. 혈장 Lactate dehydrogenase(LDH)의 활성 ... 184
• 4. 혈장 bilirubin ... 185
• 5. 혈장 Albumin ... 186
• 6. 혈장 γ-glutamyltranspeptidase(γ-GT)의 활성 ... 186
• 7. 혈장 Glucose ... 188
• 8. 혈장 Triglyceride(TG) ... 189
• 9. 혈장 Cholesterol(Chol)의 측정 ... 189
• 9. 간의 조직학적 소견 ... 191
• 제2절 알코올로 유도한 SD Rat의 급성간손상과 만성간손상에 대한 GF-AS의 항산화효과 ... 195
• 1. Superoxide dismutase(SOD)의 활성 ... 195
• 2. Glutathione Peroxidase(GPx)의 활성 ... 195
• 3. Glutathione Reductase(GR)의 활성 ... 196
• 4. Catalase의 활성 ... 198
• 5. Glutathione(GSH)의 함량 ... 200
• 6. Malondialdehyde(MDA)의 생성 ... 200
• 제3절 GF-AS의 알코올 해독작용 ... 202
• 1. Ethanol로 유도한 만성간손상에서의 알코올대사 효소의 활성 ... 202
• 2. Ethanol로 유도한 급성간손상에서의 알코올 농도와 대사효소의 활성 ... 204
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 206
• 제1절 제 1 세부과제 ... 206
• 1. 연도별 목표에 대한 고찰 ... 206
• 2. 평가착안점에 입각한 연구목표의 달성도 ... 209
• 제2절 제 2 세부과제 ... 210
• 1. 연도별 목표에 대한 고찰 ... 210
• 2. 평가착안점에 입각한 연구목표의 달성도 ... 217
• 제3절 제 3 세부과제 ... 218
• I. 연도별 목표에 대한 고찰 ... 218
• 1. 기능성 가시오가피 복합제의 보간효과 ... 218
• 2. 가시오가피 복합제(GF-100, GF-200)와 활성분획(GF-AS)의 in vitro 항산화효과 ... 218
• 3. CCl₄에 의한 간장 손상에 있어서 가시오가피 활성분획 GF-AS의 보호효과 ... 218
• 3. Alcohol-induced hepatotoxicity ... 220
• 4. Alcohol Metabolism ... 220
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 222
• 제1절 면역기능이 증강된 차세대 백신개발의 가능 ... 222
• 제2절 면역억제제 ... 222
• 제3절 보간기능을 가지는 기능성 식품의 개발 ... 223
• 제4절 일반적인 기능성을 갖는 식품의 소재 ... 223
• 제6장 연구개발과정중 수집한 해외과학기술정보 ... 224
• 제1절 개발 대상기술의 중요성 및 국내ㆍ외 관련기술의 현황 ... 224
• 제2절 가시오갈피에 대한 연구 동향 ... 224
• 제7장 참고문헌 ... 226
• 끝페이지 ... 236