초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 바이러스 분리 동정 및 증식
사과 및 감귤나무에 감염하는 바이러스 분리를 위해 ELISA 방법에 의해 선별하였다. 이때 ELISA에 사용된 항체는 스위스 BIOREBA사로부터 구입하였다. 선발된 바이러스 감염주는 Chenopodium quinoa 등 지표 식물을 이용하여 신초 및 꽃에 접종함으로써 바이러스를 증폭 분리하였다. 사과와 감귤에 감염하는 ACLSV, ASGV, CTLV SDV를 분리하였으며, CTV는 제주감귤연구소에서 제공받았다.
나.

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 바이러스 분리 동정 및 증식
사과 및 감귤나무에 감염하는 바이러스 분리를 위해 ELISA 방법에 의해 선별하였다. 이때 ELISA에 사용된 항체는 스위스 BIOREBA사로부터 구입하였다. 선발된 바이러스 감염주는 Chenopodium quinoa 등 지표 식물을 이용하여 신초 및 꽃에 접종함으로써 바이러스를 증폭 분리하였다. 사과와 감귤에 감염하는 ACLSV, ASGV, CTLV SDV를 분리하였으며, CTV는 제주감귤연구소에서 제공받았다.
나. 목본성 작물로부터 고순도 RNA 추출법 개발
고농도의 RNA 추출방법 개발 수행에 있어서는 바이러스가 증식된 초본 기주의 잎과 목본성 기주의 잎조직을 비교하여 식물체로부터 total RNA를 추출하였다.
추출 방법은 상품으로 판매되는 Qiagen RNeasy Plantmini kit와 주로 동물에서 많이 사용되는 NucliSens Kit를 사용하여 추출 RNA 농도 및 순도를 조사하였다. 또한 목본작물에서 특히 저농도로 존재하는 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있도록 순도가 높은 viral 핵산을 분리하였다. PCR반응에 저해작용을 하는 페놀성 물질들을 제거하기 위해 PVP 등 산화억제 작용을 하는 물질들을 종류별로, 농도별로 처리하여 최적의 완충액 조성방법 등 고농도의 RNA 추출을 위한 효율적인 방법을 개발하기 위한 시험을 수행하였다. 이를 통해 사과나 감귤 잎 조직으로부터 고농도, 고순도의 RNA를 분리할 수 있었으며 특히 Qiagen kit(독일)를 사용하였을 때 추출 RNA의 순도가 높아 PCR 반응효율을 높일 수 있었다. 세계적으로 감자 외에는 사용한 예가 거의 없는 NucliSens kit(네덜란드)를 식물에 적용한 결과, 비교적 높은 농도의 RNA를 얻을 수 있었으나 순도가 다소 떨어지는 것으로 나타났다. 일반적으로 사용되는 Phenol-chloroform법을 이용하여 사과 잎 조직으로부터 추출한 RNA는 ACLSV가 증식된 C. quinoa 기주를 이용한 경우에 비하여 매우 농도가 낮아 효과적으로 PCR 진단이 불가능하였다.
다. RT-PCR을 통한 ASGV, ACLSV, CTLV, CTV 유전자 증폭
국내에서 분리된 ASGV(apple stem grooving capillovirus), ACLSV(apple chlorotic leaf spot virus), CTLV(citrus tatter leaf virus), CTV(citrus tristeza virus) 로부터 genomic RNA를 추출하여 RT-PCR에 이용하였다. 기존에 알려진 이들 바이러스의 염기서열을 바탕으로 염기서열 보존이 비교적 잘 되어 있는 CP(coat protein), RNA polymerase 유전자 부위를 선택하여 RT-PCR의 primer로 이용하였다. RT-PCR을 수행한 결과 ACLSV, ASGV CP는 566 bp와 503 bp, ASGV RNA polymerase 유전자 N-terminal 부위에 해당하는 573 bp 의 증폭된 band을 확인하였
다. 감귤에 감염하는 CTLV, CTV 로부터 CP 유전자에 해당하는 503 bp와 672 bp 길이의 증폭된 DNA band을 확인하였다.
라. 각 바이러스의 CP(coat protein) 혹은 RNA polymerase 유전자의 염기서열 결정
과수에서 분리된 ASGV, ACLSV, CTLV, CTV 바이러스의 CP 및 ASGV RNA polymerase N-terminal 부위 유전자 염기서열 결정하기 위해 RT-PCR에 의한 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T vector에 클로닝한 후 클로닝 된 3개 이상의 clone들의 각 각 염기서열을 결정하였다. 결정된 바이러스 유전자의 염기서열을 기존에 genome data base에 보고된 유전자의 염기서열과 각각 비교한 결과 국내 사과의 ASGV, ACLSV CP, ASGV RNA polymerase N-terminal 부위 유전자 염기서열이 각각 57개, 136개, 118개의 위치에서 서로 다른 염기서열을 갖고 있었고 각각 88.7%, 75.9%, 79.4% 정도의 유사성을 보였다. 감귤에서 분리된 CTLV, CTV CP 유전자 염기서열 결정하여 같은 방법으로 비교한 결과 국내 CTLV, CTV CP 유전자는 기존에 알려진 CTLV, CTV CP 유전자와 26개, 47개의 위치에서 서로 다른 염기서열을 갖고 있었고 각각 94.8%, 93.0% 정도의 유사성을 보였다.
마. 사과에 감염하는 ASGV, ACLSV 검색을 위한 바이러스 특이적 primer 선발
ASGV의 CP 및 RNA polymerase 유전자의 염기서열을 바탕으로 다양한 primer를 제작하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 바이러스 DNA가 성공적으로 증폭되는 primer set (ASGV-Pf, ASGV-Pr)을 선발하여 ASGV 검색에 이용될 수 있음을 확인하였다. ACLSV의 경우는 CP 유전자의 염기서열을 바탕으로 다양한 primer를 제작하여 RT-PCR에 이용하였다. 그 결과 바이러스 DNA가 성공적으로 증폭되는 primer set (ACLSV-CPf, ACLSV-CPr)을 선발하여 ACLSV 검색에 이용될 수 있음을 확인하였다.
바. 감귤에 감염하는 CTLV, CTV 검색을 위한 바이러스 특이적 primer 선발
CTLV의 CP 유전자의 염기서열을 바탕으로 다양한 primer를 제작하여 RT-PCR에 이용하였다. 그 결과 바이러스 DNA가 성공적으로 증폭되는 primer set(CTLV-CPf, CTLV-CPr)를 선발하여 CTLV 검색에 이용될 수 있음을 확인하였다. 또한 CTV의 CP 유전자의 염기서열을 바탕으로 다양한 primer를 제작하여 RT-PCR에 이용하였다. 그 결과 바이러스 DNA가 성공적으로 증폭되는 primer set (CTV-CPf, CTV-CPr)을 CTV 검색에 이용될 수 있음을 확인하였다.
사. 바이러스 동시 진단을 위한 duplex PCR 개발
2종의 바이러스 ASGV와 ACLSV, 혹은 CTLV와 CTV를 동시에 진단할 수 있도록 선별된 각각의 primer들과 각각의 바이러스들의 RNA을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 바이러스 동시 진단 PCR 방법을 개발하였다. ASGV와 ACLSV의 경우 404 bp와 566 bp 크기의 DNA 가 증폭되어 젤 상에서 동시에 그 감염을 진단할 수 있었으며, 각 바이러스 genome을 함유하고 있는 RNA를 다양한 농도별로 혼합하여 각 DNA band의 sensitivity를 확인할 수 있었다. 또한 감귤의 바이러스 CTLV와 CTV의 경우도 같은 방법으로 503 bp와 372 bp 크기의 DNA 가 증폭되어 젤 상에서 동시에 그 감염을 진단할 수 있었으며, 각 band의 sensitivity를 확인할 수 있었다.
아. RT-PCR에 대한 양성 대조군 primer 선발
RT-PCR을 통해 바이러스의 검색은 RNA 추출 방법 혹은 오염물질 등에 의해 RNA 로부터 증폭이 잘 되지 않는 경우가 있다. 따라서 실제 바이러스에 의해 감염이되었을 지라도 결과는 음성으로 잘못 판정할 수 있는 가능성이 있다. 이를 배제하기 위해 RT-PCR에 대한 양성 대조군(control) primer가 반드시 필요하다. 이를 위해 모든 생물의 translation에 필요하고 그 염기서열이 보존이 잘 되어 있는 인자인 EF1-a(Elongation Factor 1a) 유전자 부위에 대한 다양한 primer를 선별하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 들 중에 선별된 primer는 EF1a-Pf와 EF1a-Pr였으며, 이 primer와 감귤과 사과의 잎에서 추출한 total RNA을 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과 예상대로 236 bp의 DNA가 증폭되었다. 또한 대조군 primer을 동시 진단 duplex PCR 에 포함하여 그 사용 가능성을 타진하였다. 양성대조군 primer EF1a-Pf, EF1a-Pr primer를 RT-PCR에 첨가한 결과 ASGV, ACLSV, EF1a에 해당하는 404 bp, 566 bp, 236 bp의 DNA가 증폭되었다. 감귤의 경우는 503 bp, 372 bp, 236 bp DNA 가 증폭되었다. 따라서, 두 경우 모두 양성 대조군 primer가 바이러스 검출에 문제가 없다는 것을 확인하였다.
자. 과수 잎으로부터의 ASGV, ACLSV, CTLV, CTV 바이러스의 진단 실용성 검정ASGV, ACLSV, CTLV, CTV 바이러스들의 검색을 위한 선발된 각 바이러스 특이적 primer가 실제 실용성이 있는 지를 조사하였다. 이를 위해 재배중인 농가원에서의 사과와 감귤 성목의 신초를 채집하여 PCR 진단 실용성을 시험하였다. 시험 결과 ACLSV, ASGV, CTLV. CTV에 특이적인 primer를 이용하여 이들 바이러스 감염주들을 특이적으로 검출할 수 있음이 밝혀졌다.
차. PCR에 의한 진단과 기존의 ELISA에 의한 진단의 바이러스 검출율 비교
본 연구를 통해 개발된 PCR 진단 방법과 기존에 이용되고 있는 ELISA에 의한 진단 방법을 감도면에서 비교 분석하였다. 사과 과수원에서 재배되고 있는 7-10년생 성목의 신초를 채집하여 ACLSV에 대한 진단 결과 ELISA 방법에 의해 53% 검출율을 보인데 반해 PCR 진단 방법을 통해서는 66%의 검출율을 나타내었다. 따라서 PCR 진단 방법이 보다 정밀하게 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있음을 확인하였
다. 또한 duplex PCR 기술을 이용한 바이러스 동시 진단의 실용성도 검정하였다. 사과 주요 재배지역인 경북 봉화 등 7개 지역에서 채집한 시료를 이용하여 ELISA와 비교 진단한 결과, ELISA에서 바이러스 검출율이 11.5%인데 비해 duplex PCR에 의해서는 22.4%의 검출율을 보여 duplex PCR의 검출 정밀도가 더 높은 것으로 확인되었다.
감귤원의 성목 진단에서는 엽병을 포함한 잎조직과 개화기 꽃을 채집하여, CTLV와 CTV에 대해 ELISA 및 duplex PCR 진단결과 ELISA에 의해 검출되지 않은 CTLV가 PCR에 의해 효과적으로 검출이 가능하였고, 또한 CTLV와 CTV가 복합적으로 검출되어 duplex PCR의 가능성을 확인할 수 있었다. CTV 진단 항체를 보유하지 않아 ELISA진단을 수행하지 못하였지만 duplex PCR에 의해 CTV 감염주를 효율적으로 선발할 수 있었다.
Duplex PCR에 의해 2종의 복합감염 여부를 확인할 수 있어 한번의 PCR로 2 종의 바이러스 진단이 가능함으로써 비용이나 노력면에서 경제성이 높아 실용가치도 매우 높을 것으로 판단되었다.
카. 대조군 primer 포함한 2종 바이러스 동시진단 duplex PCR 진단기술의 실용성 검정
최종적으로 개발된 대조군 primer 포함한 2종의 바이러스 동시진단 duplex PCR 진단기술을 농가에서 채집한 사과와 감귤의 잎을 이용하여 진단 실용성을 검정하였다. 그 결과 사과의 경우에 ASGV, ACLSV, EF1a에 해당하는 404 bp, 566 bp, 236 bp의 DNA가 증폭되었다. 감귤의 경우는 CTV, EF1a에 해당하는 372 bp, 236 bp DNA가 증폭되었고 CTLV는 검출되지 않은 것을 보아 채집한 감귤잎에서는 감염된 CTLV가 없다는 것을 알 수 있었다. 따라서 두 경우 모두 양성 대조군과 바이러스들의 검출에 문제가 없다는 것을 확인하였다.

Abstract ▼

Apple and citrus trees are one of the most widely grown fruit corps in Korea. They are widely infected by various viruses and their yields are significantly reduced by the infections. It has been known that the major viruses infecting apple and citrus in Korea are apple stem grooving virus (ASGV) an

Apple and citrus trees are one of the most widely grown fruit corps in Korea. They are widely infected by various viruses and their yields are significantly reduced by the infections. It has been known that the major viruses infecting apple and citrus in Korea are apple stem grooving virus (ASGV) and apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), and citrus tristeza virus (CTV), citrus tatter leaf virus (CTLV), and satsuma dwarf virus(SDV), respectively.
ASGV is a member of the genus Capillovirus and a single stranded
RNA and the total genome size is a 6.5 kb. ASGV causes a serious disease in apples growing Malus sieboldii rootstocks. ACLSV is a member of the genus
Trichovirus from the Closterovirus group and a single stranded RNA and the total genome size is a 7.56 kb and the symptoms are irregular chlorotic rings and line patterns and prematurely small leaves shed.
CTV is a member of the closterovirus group and a single-stranded RNA virus and the total genome size is a 17-20 kb. CTV caused rapid decline in growth , stem pitting, and death. CTLV is a member of the Capillovirus group and a single stranded RNA and the total genome size is a 6.5kb. CTLV is serologically related with ASGV and the symptoms are chlorotic local lesions and tatter leaf. SDV is a member of the Nepovirus group and a single stranded RNA and the total genome size is 10.1 kb and the symptoms are leaf malformation and rosetting.
The early diagnosis of the viral infection is very economically important for crop production. The most common techniques for plant virus diagnosis are based on serological method using the specific monoclonal antibodies. However, these methods are not sensitive enough for detection of viral RNA targets in some woody plant tissue due to the low viral titers. In addition, ELISA test is only reliable when virus titer is high after several month of growth. Therefore, it is very hard to diagnose the viral infection in the early stage. Recently, nucleic acid-based diagnostic techniques such as RT-PCR are being used for the detection of small number of virus. RT-PCR assay is known to be more sensitive than ELISA.
To develop the diagnostic method for the viral infection, we characterized the coat protein genes for the ASGV, ACLSV, CTLV, CTV and the N-terminal of RNA polymerase gene of ASGV in Korea. The sequence analysis of the coat proteins genes of ASGV, ACLSV, CTLV, CTV RNAs and the N-terminal of RNA polymerase gene of ASGV in Korea revealed that they have about 88.7%, 75.9%, 94.8%, 93.0% and 79.4% identity to those previously reported, respectively.
Base on the nucleotide sequences of the viral genes, we could design the virus gene-specific primers for the detection of ASGV and ACLSV in species of Malus, and CTLV and CTV in species of Citrus. The RT-PCR using the primers for the genes of ASGV, ACLSV, CTLV, and CTV, successfully gave rise to 404, 566, 503 and 372 bp DNA fragments respectively. Using those viral gene-specific primers, we have also established the duplex RT-PCR assays to diagnose the infection by ASGV and ACLSV, or CTLV and CTV simultaneousely.
Furthermore, we designed the control primers which has to be included for the RT-PCR as a positive cotrol. We chose the primers specific for Elongation Factor 1a(EF1a) gene as a positive control, since the gene is absolutely required for all the plant and highly conserved. The RT-PCR using the positive control primers successfully amplified the 236 bp DNA fragments corresponding to the EF1a gene.
We have tested the RT-PCR diagnostic methods whether they can be successfully applied in the field. We tested many samples of Malus and Citrus collected from the diverse locations in Korea. We could successfully detect the viral infections using the duplex RT-PCR as well as single set of RT-PCR. We compared the sensitivity of the RT-PCR method with ELISA method for the detection of the viral infection. It turns out that RT-PCR methods are more reliable and more sensitive for the detection of ASGV and ACLSV, or CTLV and CTV than ELISA test. Therefore, we concluded that the RT-PCR diagnostic methods established in this study can be used in the fields for early detection of the viral infection.
The availability of these informations will lead to the development of diagnostic methods to identify the other major fruit viruses and will make use of prevention of the fruit viruses and selection of the virus-free seedling.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 14
• 목차 ... 16
• 제 1 장. 연구개발과제의 개요 ... 18
• 제1절. 연구개발의 필요성 ... 18
• 제2절. 연구개발의 목표와 범위 ... 20
• 제 2 장. 국내외 기술개발의 현황 ... 21
• 제 3 장. 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 23
• 제1절. 연구개발 내용 ... 23
• 제2절. 과수 바이러스 유전자 클로닝 및 PCR을 이용한 바이러스 진단기술 개발(제 1세부과제) ... 26
• 1. 서 론 ... 26
• 2. 연구 재료 및 방법 ... 29
• 3. 결과 및 고찰 ... 35
• 4. 적 요 ... 80
• 제3절. PCR을 이용한 과수바이러스 진단기술의 실용성 검정(협동 과제) ... 82
• 1. 서 론 ... 82
• 2. 연구 재료 및 방법 ... 84
• 3. 결과 및 고찰 ... 90
• 4. 적 요 ... 116
• 제 4 장. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 119
• 제1절. 목표달성도 ... 119
• 제2절. 관련분야에의 기여도 ... 120
• 제 5 장. 연구개발결과의 활용계획 ... 121
• 제 6 장. 참고문헌 ... 122
• 끝페이지 ... 130