초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구에서는 축산식품 유래 인수공통 전염병의 원인체로 작용하는 병원성 미생물에 대한 신속한 검출 및 추적이 가능한 분자 생물학적 기법을 개발하여 축산식품 내병원성 미생물을 신속하고 정확하게 진단할 수 방법을 개발하고자 하였다.
1. 연구개발 결과
가. 제1세부과제 : 가공육과 포장육에서 병원성 세균의 신속 검출 기법 개발
1) 축산식품 유래 병원성 세균의 배양 및 동정 조건 확립을 식중독 원인 병원성 세균의 표준균주를 이용하여 병원성 세균별로 각 세균의 분리에 적합한

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구에서는 축산식품 유래 인수공통 전염병의 원인체로 작용하는 병원성 미생물에 대한 신속한 검출 및 추적이 가능한 분자 생물학적 기법을 개발하여 축산식품 내병원성 미생물을 신속하고 정확하게 진단할 수 방법을 개발하고자 하였다.
1. 연구개발 결과
가. 제1세부과제 : 가공육과 포장육에서 병원성 세균의 신속 검출 기법 개발
1) 축산식품 유래 병원성 세균의 배양 및 동정 조건 확립을 식중독 원인 병원성 세균의 표준균주를 이용하여 병원성 세균별로 각 세균의 분리에 적합한 증균배지, 선택배지와 그에 따른 배양 조건을 전통적인 미생물학적 방법에 따라 확립하였다. 이와 같이 확립한 방법을 통하여 각 시험세균을 증균할 수 있었고, 적절한 배양 조건 하에서 선택배지를 이용하여 병원성 세균별로 분리하여 동정할 수 있었다.
2) 전통적인 미생물학적인 검사 방법에서의 미생물 분리 배양 시간을 단축함으로써 단시간 내에 식품에 오염된 각종 미생물을 신속하게 검출하기 위하여 병원성 세균의 표준균주를 이용한 single PCR 기법을 확립하였다. E. coli O157:H7과 같은 Shiga-like toxin 생성 대장균 검출을 위하여 SLT-1 유전자를 대상으로 하였으며, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus 및 Yersinia enterocolitica 검출을 위하여 각 세균별로16S rDNA 유전자를 대상으로 한 특이적인 primer를 제작하여 각 세균별 single PCR 기법을 확립하였다.
3)식품 유래 병원성 세균 5 종에 대한 오염 미생물을 단 한 번의 PCR 반응으로 신속하게 검출하기 위하여 single PCR 방법에 사용한 각종 primer set를 혼합하여 multiplex PCR system을 설계하고 실험하였다. 본 연구에서 고안한 multiplex PCR 반응 결과 각 세균별로 특이적인 증폭산물인 593 bp (Yersinia enterocolitica), 416bp (Salmonella spp.), 354 bp (SLT-producing E. coli), 335 bp (S. aureus), 298 bp(Listeria spp.)의 DNA band가 뚜렷하게 구분되어 표준균주 세균별로 특이적인 band pattern을 확인할 수 있었다.
4) Multiplex PCR에서 Shiga-like toxin producing E. coli로 판정된 세균의 경우 E. coli O157:H7 여부를 판독하기 위하여 E. coli O157:H7이 보유하고 있는 SLT-I･II, eaeA, 60-MDa plasmid 유전자에 대한 특이 oligonucleotide primer를 PCR 반응 완충액에 넣어 다중 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 317 bp (eaeA), 228 bp (SLT-I･II), 167 bp (60-MDa plasmid)의 PCR 증폭 DNA 생성물을 표준균주(E. coli ATCC 35150)에서 확인할 수 있었다.
5) S. aureus로 확인된 시료의 경우에는 장독소를 생성하는 S. aurues가 보유한 장독소 type A, B, C, D, 및 E 등의 5종의 유전자에 특이적인 primer set를 혼합하여 multiplex PCR 반응을 시행한 결과 127 bp (SEA), 477 bp (SEB), 271 bp (SEC), 319 bp (SED), 178 bp (SEE)의 PCR 증폭 DNA 생성물을 각 장독소 생성 표준세균주 별로 모두 확인할 수 있었다.
6) L. monocytogenes의 16S rDNA에 염기서열에 근거한 LM1-LM2 primer set와 병원성 L. monocytogenes가 생성하는 listeriolysin O 유전자인 hlyA gene에 특이 적인 UhlyA- LhlyA primer set를 사용하여 duplex PCR을 실시하였다. 이 결과 L. monocytogenes에서는 298 bp 및 613 bp의 band를 확인할 수 있었으나, L. innocua의 경우에는 298 bp의 amplicon만이 생성되었다. 한편 L. grayi 등의 다른 Listeria spp.와 기타 균주에서는 PCR 생성물이 확인되지 않았다.
7) 각각의 single PCR 및 multiplex PCR에서 양성으로 검출된 시료의 결과를 다시 한번 확인하기 위하여 각각의 표준균주별로 PCR 반응에서 증폭이 예상되는 DNA 염기서열 중 각 대상세균에 특이적인 16S rDNA sequence에서만 확인되는 부분을 선택하여 제작한 대상균주 별로 특이적 probe DNA를 이용하여 blotting을 실시하였다. 이 결과 Staphylococcus aureus PCR product에만 STA-P probe DNA가 결합하였으며, Salmonella PCR product에 SAL-P probe DNA가 결합하여 signal band가 확인되었다. 이 밖에도 Listeria spp.와 Yersinia enterocolitica의 경우에도 동일한 결과로 나타났다.
나. 제2세부과제 : 가공육과 포장육 유래 병원성세균의 추적기술 개발
1) RAPD 기법을 이용하여 동일 균종 내의 균주 감별기법의 확립을 시도하였던바, URP primer-9를 사용하였을 때 E. coli와 Salmonella의 각각 두 strain외에는 모두 감별할 수 있었고 URP primer-3, 6과 같이 각 균주의 종내에서 뿐만 아니라 종간에도 감별할 수 있었다. 따라서 URP primer 3, 6, 9는 종간 감별에 있어 매우 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
2) ERIC primer를 이용하여 연구대상 균종 5종의 표준균주를 이용하여 ERIC-PCR을 실시하였다. 균주 간에 band 다형성의 차이를 확인해 본 결과인 전반적으로 200 bp에서 1700 bp 사이에서 band 다형성을 확인할 수 있었으며, 각 종간의 band 다형성의 경향이 상이함을 알 수 있었다. 또한 각 대상 세균 종의 균주별로도 band 다형성의 차이를 나타내어 각 균주 내의 strain 간의 차이를 구별할 수 있는 하나로 판단되었다.
3) 16S rRNA를 이용한 ribotyping은 각 균주내에 strain차이는 구별하기 힘들었지만 균주 사이에 차이는 특이하게 보이는 band의 확인으로 가능할 것으로 보였다.
하지만 ERIC PCR과 ribotyping PCR 방법의 조합으로 신속하고 정확하게 균주와 그 strain을 확인할 수 있는 가능성을 보였다고 할 수 있겠다.
4) 신속하고 정확한 세균 동정을 위한 rpoB 유전자 부위의 PCR-RFLP 기법을 개발하였다. 본 연구에서 제작한 rpoB primer를 이용한 PCR 산물을 제한효소는 Alu I 을 사용하여 소화한 다음 그 결과에 따라 S. aureus, L. monocytogenes, Yersinia spp.를 감별할 수 있었다. 한편 Alu I 제한효소로 처리시 감별이 되지 않는 E. coli와 Salmonella의 경우에는 Msp I으로 처리하면 세균의 동정이 가능할 것으로 추정할 수 있었다.
다. 제1 및 제2 협동과제 : 경기도 지역 및 강원도 지역 가공육 및 포장육오염 실태 조사
1) 가공육 및 포장육 유래 병원성 세균에 대한 신속 검출 기법을 축산식품의 검사 현장에서 연구기간 3년 동안 수거한 총 5,520건의 시료에서 전통적인 미생물학적 방법에 따라 분리 배양을 실시한 결과 Salmonella spp. 147주(2.7%), E. coli O157:H7 2주(0.036%), Listeria monocytogenes 67(1.2%)주 및 S. aureus 263주(4.8%)의 병원성 세균을 분리･동정하였다.
2) 병원성 세균의 분리 지역별로는 경기도 지역의 3,421 도축 시료 중 141개(4.1%)의 시료에서, 강원도 지역의 2,099 시료 중 모두 336개(16.0%)의 시료에서 병원성 세균이 검출되어 경기도 지역보다 강원도 지역의 병원성 세균 오염율이 훨씬 높은 것으로 나타났다.
3) 병원성 세균의 오염 분포도를 조사한 결과 경기도 지역에서 S. aureus 65 균주, Salmonella spp. 41 균주, Listeria monocytogenes 35 균주의 순으로 검출되었으며, 강원도 지역에서는 S. aureus가 198 균주로 가장 높은 검출율을 보였고 Salmonella spp.는 106 균주, Listeria monocytogenes는 32 균주의 순으로 병원성 세균이 검출되었다.
4) 분자생물학적인 병원성 세균 검출 기법의 현장 적용성 평가를 위하여 multiplex PCR 시험과 미생물학적인 방법에 따라 분리한 병원성 세균 분리 성적의 비교 검토를 실시하였다. Multiplex PCR 시험에서 Salmonella spp.가 양성으로 나타난 41 시료에서 분리한 세균 중 38 균주에서 Salmonella spp.에 특이적인 416 bp 특이밴드를, Listeria monocytogenes가 양성으로 나타난 35 시료에서 분리한 세균 중 32 균주에서 Listeria monocytogenes에 특이적인 299 bp 특이밴드를 확인할 수 있었으며, S. aureus가 양성으로 나타난 65시료에서 분리한 세균 중 47 균주에서 S. aureus에 특이적인 335 bp 특이밴드가 확인되었다.

Abstract ▼

In order to develop the molecular biological methods for the rapid detection and molecular typing of the contaminated microorganisms in beef and pork produced in Korea, several kinds of polymerase chain reactions protocols, based on the 16S rDNA and appropriate gene sequences of bacteria, were estab

In order to develop the molecular biological methods for the rapid detection and molecular typing of the contaminated microorganisms in beef and pork produced in Korea, several kinds of polymerase chain reactions protocols, based on the 16S rDNA and appropriate gene sequences of bacteria, were established. The major objective bacteria in this research were Shiga-like toxin producing Escherichia coli and E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, and Yersinia enterocolitica, respectively. At the same time, microbiological contamination of beef and pork produced in Kyunggi and Kangwon Province was investigated with PCR detection methods developed in this research.
1. Rapid Detection of Pathogenic Bacteria in Beef and Pork
1) Using appropriate enriched media and selective media, the standard procedures for the microbiological isolation and identification of pathogenic bacteria contaminated in beef and pork were established with the reference type strains of objective bacteria.
2) For the rapid detection of objective pathogenic bacteria from beef and pork samples, single PCR methods were developed. The respective primer sets used in these PCR system were designed based on the 16S rDNA sequences of Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica.
In case of SLT-producing E. coli and E. coli O157:H7 strains, primer set was designed based on the sequence of Shiga-like toxin gene of SLT-producing E. coli.
3) To detect simultaneously 5 kinds of pathogenic bacteria contaminated in meat samples in a single reaction tube, multiplex PCR system was developed using 5 sets of primers used in single PCR system for respective bacteria. In this multiplex PCR system, 5 kinds of specific DNA fragments (593 bp, Yersinia enterocolitica;, 416 bp, Salmonella spp.; 354 bp, SLT-producing E. coli;, 335 bp, S. aureus;, 298 bp Listeria spp.) were successfully amplified with respective template DNA specimens. This result might indicate the capability of rapid detection and differentiation between 5 species of objective bacteria in a single reaction.
4) Multiplex PCR system was designed to detect the genes of SLT-I･.II, eaeA, and 60-MDa plasmid of E. coli O157:H7, simultaneously. The 3 DNA bands specific to respective genes(317 bp, eaeA; 228 bp, SLT-I․.II; 167 bp, 60-MDa plasmid) were successfully amplified in this multiplex PCR.
5) Mutiplex PCR system for the detection of enterotoxigenicity in S. aureus, using 5 sets of oligonucleotide primers for enterotoxin A to E genes (entA, entB, entC, entD, and entE), was designed. Oligonucleotide primers were to meet the requirements of both good size-distinguishable amplification bands of multiplex PCR(127 bp, SEA;, 477 bp, SEB; 271 bp, SEC; 319 bp, SED; 178 bp, SEE).
6) Duplex PCR system for the differentiation of Listeria monocytogenes from other Listeria spp. was designed using LM1-LM2 primer set based on the sequence of 16S rDNA and UhlyA-LhlyA primer set based on the hlyA gene of Listeria monocytogenes. In this duplex PCR system, 298 bp and 613 bp DNA bands were amplified simultaneously in L. monocytogenes DNA. However, only 298 bp DNA band was identified in L. innocua DNA, and no specific DNA band was amplified in other strains of Listeria spp. including L. grayi.
7) For the further confirmation PCR results, oligonucleotide probes for the 16S rDNA of L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus and Y. enterocolitica were separately used for Southern hybridization of amplified DNA from the multiplex or single PCRs. The specifically amplified DNA of all reference strains were confirmed by the specific oligonucleotide probes in Southern blot analysis. Thus, the corresponding genes were correctly recognized.
2. Development of Molecular Typing Methods for Pathogenic Bacteria from Meats
1) Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) PCR methods were established for the differentiation of food-contaminating pathogenic bacteria from meats. Fairly good differentiation between strains of E. coli and Salmonella was possible to the strain level in RAPD PCR with URP-9 primer.
2) Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) PCR methods were established for the 5 kinds of objective bacteria. In the ERIC PCR, polymorphism of amplified DNA was marked ranging from 200 bp to 1700 bp in tested strains.
The different banding patterns of objective strains would indicate the applicability of ERIC PCR for the differentiation of food-poisoning agents to strain level.
3) Molecular differentiation between objective bacteria was not possible to the strain level, but it was still possible to species level in ribotyping based on the sequences of 16S rRNA. However, the combination of ERIC PCR and ribotyping PCR was regarded as useful molecular typing methods for rapid differentiation of pathogenic bacteria from meats to strain level.
4) PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis method was developed for the rapid and precise identification of pathogenic bacteria based on the diversity of rpoB gene. Differentiation of strains between S. aureus, L. monocytogenes, and Yersinia spp. was possible in rpoB PCR amplicons digested with Alu I. The differentiation between strains of E. coli and Salmonella was made by Msp I digestion of rpoB PCR products.
3. Survey on the Contamination of Meat in Kyunnggi and Kangwon Province
1) One hundred and forty seven (2.7%) strains of Salmonella spp., 2 (0.036%) strains of E. coli O157:H7, 67 (1.2%) strains of Listeria monocytogenes and 263 (4.8%) strains of S. aureus were isolated from a total of 5,520 beef and pork specimens during 3 years (1999∼.2002).
2) While 141 (4.1%) strains of pathogens isolated from 3,421 specimens in Kyunggi Province, 336 (16.0%) strains of pathogens isolated from 3,421 specimens in Kangwon Province. Contamination rate of pathogenic bacteria appeared much higher in Kangwon Province, compared with those of Kyunggi Province.
3) The most frequently isolated pathogens were S. aureus (65 strains in Kyunggi, 198 strains in Kangwon), followed by Salmonella spp. (41 strains in Kyunggi, 106 strains in Kangwon) and Listeria monocytogenes (35 strains in Kyunggi, 32 strains in Kangwon) in that order.
4) Field applicability molecular biological detection and typing methods for pathogens was evaluated with classical microbiological methods. Among the 41 isolated strains from specimens appeared to be positive in Salmonella spp. with multiplex PCR, 38 strains showed also positive signal of 416 bp Salmonella spp.-specific DNA band. Similar tendencies of confirmation results were obtained in Listeria monocytogenes and S. aureus, respectively.
4. Applicability of Research and Recommendations
The current meat hygiene programs for the microbiological control in Korea entirely depend on the microbiological detection from meat specimens. The main disadvantage of microbiological detection method cannot be succumbent due to the incubation time for bacterial isolation and identification. In this research project, rapid detection and molecular typing methods were developed by means of molecular biological analysis. Based on the obtained results of this research project, the following applicability and recommendations were drawn for effective control of microorganisms in meat.
1) Molecular biological detection and typing of pathogens contaminated to the meat would provide the exact characteristics and relationships of pathogens among wild type strains in the fields. The results of this research project can be used as basic data for the survey of current status on microbiological contamination and for the prevention of diseases.
2) The developed molecular biological detection and typing methods can be transferred to the local laboratories of national veterinary quarantine service institute. These new methods should be applied in control program for meat hygiene along with the microbiological control program. National program guidelines for meat hygiene should be re-written immediately to include the molecular biological methods for the microbiological control measures.
3) The molecular biological detection and typing methods for pathogenic bacteria may contribute to the early establishment of revised national guidelines for meat hygiene to ensure the microbiological safety of meat.
4) The results of this research project can be applied and used for the development of commercial PCR kits for rapid detection and typing of pathogens.
The practical PCR kits would contribute to the national saving of foreign currency due to the substitution of imported PCR kits of these purposes. Furthermore, this commercial kits may be exported to foreign countries.
5) Currently the human prevalence of zoonoses in Korea due to the pathogens of bovine and swine origin was not clearly evaluated. The rapid detection and molecular typing methods established in this research project can be successfully applied to clarify and prevent the human food-poisoning caused by contaminated bacteria from cows and pigs. Therefore, the resulting minimization of economic loss for the treatment of food-poisoning may be attributed to the rapid detection and typing of pathogens.