초록 ▼

○ 연구결과
-꿀벌 질병 원인균에 대한 항균력이 우수한 미생물 자원 확보
(1)미국 부저병 원인균에 대한 항균 활성이 우수한 15종의 균주를 확보함
(2)15종의 항균활성 우수 균주 중 가장 활성이 우수한 4종의 미생물 자원 확보
(3)항균력이 우수한 4종의 미생물 자원을 이용한 노제마병에 대한 항균활성 확인
-후보균주의 생물학적 및 이화학적 특성 분석
(1)항균 활성이 가장 우수한 균주 3종을 최종 선발하여 분류학적 위치 확인
(2)L.plantarum YML001,L.plantarum YML

○ 연구결과
-꿀벌 질병 원인균에 대한 항균력이 우수한 미생물 자원 확보
(1)미국 부저병 원인균에 대한 항균 활성이 우수한 15종의 균주를 확보함
(2)15종의 항균활성 우수 균주 중 가장 활성이 우수한 4종의 미생물 자원 확보
(3)항균력이 우수한 4종의 미생물 자원을 이용한 노제마병에 대한 항균활성 확인
-후보균주의 생물학적 및 이화학적 특성 분석
(1)항균 활성이 가장 우수한 균주 3종을 최종 선발하여 분류학적 위치 확인
(2)L.plantarum YML001,L.plantarum YML004,Leu.citreum KM20
(3)선발된 3종의 균주 모두 21시간 배양시 최대 항균활성을 나타냄
(4)테트라사이클린과 선발된 균주의 항균활성을 비교한 결과,항균력이 우수하거나 유사함
(5)선발된 3종의 균주 배양 상등액을 처리하여 미국 부저병원인균의 생장을 억제 확인
(6)꿀벌에 노제마 포자를 투여후 probiotics를 처리하여 노제마 포자 발아 억제 확인
-항생기능을 갖는 물질 분석 및 특성 연구
(1)확보된 선발 균주의 배양 상등액을 NaOH로 중화시킨 결과,원 배양 상등액보다 항균력은 감소되었으나,항균력이 소실되진 않았음
(2)L.plantarum YML001의 물질 분석은 NMR을 실시하였으며,항균력을 가진 물질은 lactic acid와 유사한 물질로 판단됨
(3)L.plantarum YML004의 물질 분석은 MALDI-TOF를 실시하였으며,2가지 물질의 peak가 나타남.그중 6656.648m/z의 분자량을 가진 물질은 lacticacid이며,5043.464m/z의 분자량을 가진 물질을 확인 할 수 있었음.명확한 물질의 종류는 알 수 없었으나,배지 및 유기산과 다른 물질이 포함되어 있음을 알 수 있음
(4)선발된 균주의 배양 상등액에서 항균활성능이 있었으므로,후보물질을 획득하기 위한 cell파쇄에 따른 불필요한 공정 없이 배양액만으로도 물질 추출이 용이하여 물질 회수에 따른 편리가 있을 것으로 확인됨
(5)선발된 물질은 열처리,pH 조정을 하여도 항균 활성능이 유지되는 것을 확인함
(6)ProteaseK,Lipase,Trypsin,Pepsin,α-amylase를 처리하여 3hr동안 반응시킨 후 100℃에서 10min간 효소 불활성화하여 항균력을 조사한 결과,선발된 물질은 위 5종의 효소에 대해 감수성이 매우 적음을 확인함
(7)선발된 균주 모두 테트라사이클린에는 내성이 있었기 때문에 대량 배양에 이용할 시,배지에 테트라사이클린은 함께 섞어 배양하는 것이 공정상에 있어서 편리함.20ppm 테트라사이클린과 상등액의 혼합 비율을 설정하여 실험한 결과,상등액의 비율이 높아질수록 억제환의 크기가 대체적으로 증가하였지만,일정 혼합 비율 이상에서는 더 이상 환의 크기가 커지지 않음.
-1차 후보균주를 이용한 invivo실험 적용
(1)꿀벌의 발생과정에서 변태의 특성에 착안하여 이를 약물선발,독성판별의 다목적 test로 활용 할 수 있는 새로운 실험방법을 개발함.이를 변태독성실험법으로 명명함.변태독성실험법을 미국부저병과 노제마 질병에 저항성이 있는 probiotics선발에 적용하도록 설계 함
(2)AFB-specificReal-TimequantitativePCR법을 신규 개발함
(3) Probiotics extract와 Probiotics boiled의 치료효과는 단정 할 수 없으며, 보다 우수한 probiotics의 개발에 전력함
(4)월동 포장에서 강군들은 월동자격군으로 충분하였으나,기타 모든 약군 및 다수의 중군들은 월동자격군이 되지 못하여 월동 여부가 의심됨
(5)Nosema-specificReal-TimequantitativePCR법을 신규 개발함
(6)소비의 무게 및 벌통 무게의 변화는 고농도 probiotics를 처리한 봉군은 무게가 증가함
(7)1차 선발된 probiotics를 당액과 고농도 또는 저농도로 혼합시켜 꿀벌에게 공급하였고,대조군을 포함한 3개 실험군에 AFB를 인위 감염시켜 발병 및 확산의 정도를 측정함.전체 실험봉군에서 꿀벌시료를 채취하여 정기적으로 9종의 질병검사를 실시하였으며,자연 감염된 타 병원체의 증감정도도 실측함
(8)1차 선발된 probiotics를 당액과 당액과 고농도 또는 저농도로 혼합시켜 꿀벌에게 공급하였고, 대조군을 포함한 3개 실험군을 이 과정에서 노제마 포자로 인위 감염시키는 실험을 실시
(9)Probiotics를 처리한 각 봉군들은 대조군의 봉군들과 함께 월동포장을 하고 월동력에 차이가 있는 지를 조사
-선발된 Probiotics후보의 예방 및 치료약제 현장 적용을 위한 용법 실험
(1)시제품으로 개발된 probiotics의 생균제를 이용한 화분떡 발효
(2)AFB-probiotics함유 또는 Nosema-probiotics함유 화분떡 제조 (저,중,고,초고농도)
(3)AFB-probiotics또는 Nosema-probiotics의 과다 투여는 꿀벌의 이상 비행 활동 및 이상 행동을 야기 하지 않음
(4)AFB-probiotics화분떡 저농도 및 중농도군의 처리군은 평균 총 사체수가 낮음
(5)Nosema-probiotics화분떡 저농도 및 중농도군의 처리군은 평균 총 사체수가 낮음
(6)실험 봉군에서 꿀벌 사체수의 증가는 probiotics화분떡의 과다 투여에 의해 야기된 것으로 보기는 어려우며,probiotics농도에 따른 용량-반응 관계는 입증 되기 어려운 것으로 사료됨
(7)AFB-probiotics화분떡은 AFB 감염 봉군의 회복에 유의미한 것으로 판단
(8)Nosema-probiotics 화분떡을 처리한 각 실험군의 봉세는 초고농도 및 고농도 실험군에서 대조군을 크게 앞서는 봉세 성장을 보여 주어 Nosema-probiotics가 긍정적 성장 촉진
(9)Probiotics는 해당 두 꿀벌 질병에 의한 피해를 극복하였다 판단되며,각 probiotics의 농도는 해당 봉군의 육아권 벌집수와 용량-반응관계가 있는 것으로 판단됨
- 대량 생산 시스템의 확립 및 시제품 제작
(1)선발된 탄소원과 질소원을 그룹지어 생장률을 조사한 결과 탄소원으로는 glucose,질소원으로는 tryptone으로 이용한 대량 배지 조건에서 최대 생장률을 나타냄
(4)질소원인 tryptone을 이용한 결과 probiotics의 생장 유도기가 단축되어 생장이 촉진되는 것을 확인함
(5)미량원소를 조사한 결과 Polysorbate 80,Sodium Acetate,Ammonium Citrate, MgSO4, MnSO4,Dipotassium phosphate의 최적 비율을 선별 함
(6)기 선발된 최적 배지 조성을 기반으로 하여 7L,30L 발효조로 scaleup하였으며,probiotics의 최적 배지인 MRS 배지에 비해 10배 이상의 생장을 확인함
(7)Probiotics의 최적 생장 조건에 따라 배양 하여 시제품을 제조함
(8)항균 활성이 가장 우수했던 생육 조건인 1x10⁹ CFU/ml이상이 배양하여 생균 시제품 개발
(9)개발된 시제품은 화분떡 발효에 이용되어 현장 평가 실시함

Abstract ▼

American Foulbrood (AFB) of honeybees (Apis mellifera), caused by a Gram-positive bacterium Paenibacillus larva is one of the most serious diseases affecting the larval and pupal stages of honeybees. Nosemosis, a disease caused by a microsporidian infection, is one of the most frequently observed pa

American Foulbrood (AFB) of honeybees (Apis mellifera), caused by a Gram-positive bacterium Paenibacillus larva is one of the most serious diseases affecting the larval and pupal stages of honeybees. Nosemosis, a disease caused by a microsporidian infection, is one of the most frequently observed parasitic pathologies affecting adult honeybees. Presently, Nosema ceranae and Nosema apis seems to be the main microsporidian infection in honeybees. The aim of this study is to evaluate lactic acid (LAB) strains isolated from Kimchi and to study its inhibitory effects against Paenibacillus larvae subsP. larvae KCTC 3744 and Nosema trichoplusiae ATCC 30702. In all, 3,500 strains of lactic acid bacteria isolated from 200 types of Korean traditional kimchi were screened and three highly active bacteria were selected and were identified as Lactobacillus plantarum YML001, L. plantarum YML004 and Leuconostoc citreum KM20. The highest antimicrobial activity was achieved after culturing the three strains for 21-24 hours. In addition, temperature and pH stability assays confirms that the antimicrobial activity decreases at temperature above 50oC, however the antimicrobial activity remains un-effected after treatment with Protease K, Lipase, Trypsin, Pepsin, α-amylase 5. The optical density of P. larvae KCTC3744 with selected strains at OD600nm showed drastic decrease in cell growth as compared to control.
Three groups of honey bees(N=25) were given Nosema Spores at a concentration of 10,000 spores per ml with addition of 1% of supernatant of three strains. The bees were incubated at 37°C for seven days after infection, and the amount of spores in the mid gut was counted. We found that the three strains inhibited the growth of P. larvae KCTC3744 and N. trichoplusiae ATCC30702 and provided new perspective for probiotics of honeybees.
Further studies were conducted to know the nature of antimicrobial substance. The NMR analysis of Lactobacillus plantarum YML001 shows that the agent with high antimicrobial activity is lactic acid or similar substances. Secondly, Lactobacillus plantarum YML004 was assayed to study the nature of antimicrobial compound. A single activity peak was obtained by HPLC analysis and accurate molecular weight determination was carried out by Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALD-TOF) confirmed as 5043.464m/z. The optimizations of strains were done in different culture medium samples in order to select the most suitable medium composition for mass culture production. The most prominent culture medium composition was found to be carbon source glucose, nitrogen sources of trace elements were selected tryptone Tween 80 and Sodium acetate, Ammonium citrate, MgSO4, MnSO4, Dipotassium Phosphate was selected by examining the ratio of (20g Glucose, 5g Yeast Extract, 20g tryptone, 2g Polysorbate 80, 10g Sodium Acetate, 4g Ammonium Citrate, 0.05g MgSO4, 0.025g MnSO4, 1g Dipotassium phosphate / L).
For on-site assessment of Bee eggs and Bee larvae, candidate probiotics were applied to design and test the resistance of Bees against infection. This method was performed with a conventional unit of the bee hive with thousands of cells in each group. The responses to novel probiotic were very effective with high sensitivity. It adds an advantage against other drugs with high toxicity. The primary effect of colony infection of the candidates fed with probiotics and control bees were analyzed by real-time PCR for Nosema specific quantitative PCR and real-time PCR for quantification of Paenibacillus larvae in infected colonies. Therefore, the average number of infected bees were accurately counted and diagnosed. Furthermore, Bees after winter were provided with bee bread containing AFB-probiotics and Nosema-probiotics, infected Nosema apis colonies were medicated by AFB-probiotics, AFB-pathogen, Nosema-probiotics and how it affects the growth of every group of bees was inspected quantitatively.
This study has been conducted in various kinds of bees, under different seasons, environmental conditions and colony health. So, this is very important research to follow and will be the leading edge of bee research and would certainly help quantify what many of us have observed. In addition, probiotic supplementations include better bee survival.
The results demonstrate that these LAB probitics plays an important role not only in the Nosema or AFB tolerance, but also in the resistance to other diseases. Therefore, development of Bee probiotic would be novel application in Bee culture industry.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• Ⅰ. 제 목 ... 3
• Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 ... 3
• 1. 연구개발의 목적 ... 3
• 2. 연구개발의 필요성 ... 3
• Ⅲ. 연구개발 내용 및 범위 ... 4
• 1. 연구개발 내용 및 범위 ... 4
• Ⅳ. 연구개발결과 ... 5
• 1. 미생물 자원 확보 ... 5
• 2. 후보균주의 생물학적 및 이화학적 특성 분석 ... 5
• 3. 항생기능을 갖는 물질 분석 및 특성 연구 ... 5
• 4. 1차 후보균주를 이용한 in vivo 실험 적용 ... 6
• 5. 선발된 Probiotics 후보의 예방 및 치료약제 현장 적용을 위한 용법 실험 ... 7
• 6. 대량 생산 시스템의 확립 및 시제품 제작 ... 9
• Ⅴ. 연구성과 및 성과활용 계획 ... 10
• 1. 연구 성과 ... 10
• 2. 성과 활용 계획 ... 13
• SUMMARY ... 14
• CONTENTS ... 16
• 목 차 ... 17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 20
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 20
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 20
• 제 3 절 연구개발의 범위 ... 24
• 1. 꿀벌 질병 원인균에 대한 항균력이 우수한 미생물 자원 확보 ... 24
• 2. 후보균주의 생물학적 및 이화학적 특성 분석 ... 24
• 3. 항생기능을 갖는 물질 분석 및 특성 연구 ... 24
• 4. 기확보균주를 이용한 in vivo 실험 적용 ... 24
• 5. 봉군에 대한 Probiotics 균주 적용 및 치료 효과 ... 24
• 6. 대량 생산 시스템의 확립 및 시제품 제작 ... 24
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 25
• 제 1 절 국내외 기술 개발 현황 ... 25
• 제 2 절 국내외 기술 개발 현황에서 차지하는 위치 ... 25
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 27
• 제 1 절 미생물 자원 확보 ... 27
• 1. Paenibacillus larvae subsP. larvae KCTC 3744에 대한 항균활성 우수 균주의 탐색 ... 27
• 2. Nosema trichoplusiae ATCC 30702에 대한 항균활성 우수 균주의 탐색 ... 28
• 제 2 절 후보균주의 생물학적 및 이화학적 특성 ... 34
• 1. 항균활성 우수 균주 동정 ... 34
• 2. 항균활성 우수균주의 생장특성 ... 35
• 3. 후보균주 배양 상등액에 대한 미국 부저병 원인균의 생장억제 조사 ... 39
• 제 3 절 기 확보된 후보균주로부터 항생 기능을 갖는 물질 분석 및 특성 연구 ... 40
• 1. Probiotics 물질의 추출 및 정제 ... 40
• 2. Probiotics 물질의 특성 ... 48
• 제 4 절 1차 후보균주를 이용한 in vivo 실험 적용 ... 53
• 1. Bee egg 및 Bee larvae에 의한 probiotics후보의 저항성 test의 설계 및 적용(AFB) ... 53
• 2. Bee egg 및 Bee larvae에 의한 probiotics후보의 저항성 test의 설계 및 적용(Nosema) ... 57
• 3. 1차 선발된 probiotics후보의 Nosema 감염봉군 적용 및 수밀력, 월동력 검사 ... 58
• 4. 1차 선발된 probiotics후보의 봉군 적용 및 자연 수밀력, 산란력 검사 ... 64
• 5. 봉군 단위 예방효과검증을 위한 저∙고준위 경쟁 감염실험(AFB) ... 69
• 6. 봉군 단위 예방효과검증을 위한 저∙고준위 경쟁 감염실험(Nosema) ... 88
• 7. probiotics 처리군에 대한 월동력, 수밀력, 산란력 측정 ... 92
• 제 5 절 선발된 Probiotics 후보의 예방 및 치료약제 현장 적용을 위한 용법 실험 ... 93
• 1. 실험목적 ... 93
• 2. 실험실시의 기간 및 장소 ... 93
• 3. 실험방법 및 실험 내용 ... 93
• 4. 실험 결과 및 분석 ... 102
• 5. 꿀벌의 장내 미생물 군집 조사 ... 111
• 제 6 절 대량 생산 시스템의 확립 및 시제품 제작 ... 115
• 1. 액상 발효조를 이용한 대량 생산 시스템 확립 ... 115
• 2. 시제품개발 ... 128
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 129
• 제 1 절 연구개발목표달성도 ... 129
• 제 2 절 관련분야에의 기여도 ... 130
• 1. 기술적 측면 ... 130
• 2. 경제적, 산업적 측면 ... 130
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 131
• 제 1 절. 연구 성과 ... 131
• 제 2 절. 성과 활용 계획 ... 134
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 136
• 제 1 절 프로바이오틱스를 이용한 꿀벌 면역 증진 효과 연구 ... 136
• 제 7 장 참고문헌 ... 137
• 끝페이지 ... 139