초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 연구과제는 시스템 생물공학의 중요한 도구가 될 실시간 대사체 분석 및 대사흐름 측정 시스템을 구축하여 세포 내 대사 조절 기작을 모니터링하고, 이를 통하여 대사공학 균주의 생산성을 향상시키는 기술을 개발하는 것을 목표로 함. 이를 위하여 대사체 분석 및 non-stationary 대사흐름 측정에 필요한 샘플링, 질량분석법, 대사물질 정량화 등의 프로토콜을 확립/검증하고, 글리세롤, 5탄당 등 다양한 탄소원을 활용하는 효모의 대사체 및 대사흐름 분석에 활용한 뒤, 전사체 분석과 통합하여 시스템 생물공학을

연구의 목적 및 내용
본 연구과제는 시스템 생물공학의 중요한 도구가 될 실시간 대사체 분석 및 대사흐름 측정 시스템을 구축하여 세포 내 대사 조절 기작을 모니터링하고, 이를 통하여 대사공학 균주의 생산성을 향상시키는 기술을 개발하는 것을 목표로 함. 이를 위하여 대사체 분석 및 non-stationary 대사흐름 측정에 필요한 샘플링, 질량분석법, 대사물질 정량화 등의 프로토콜을 확립/검증하고, 글리세롤, 5탄당 등 다양한 탄소원을 활용하는 효모의 대사체 및 대사흐름 분석에 활용한 뒤, 전사체 분석과 통합하여 시스템 생물공학을 활용한 균주의 대사공학에 응용하고자 함.
연구결과
첫째, 효모의 세포내 대사체 분석을 위해 빠른 샘플링 시스템의 구축과 세포 유출 유무확인을 위한 샘플링 프로토콜을 구축하였으며 GC/MS를 이용한 세포내 대사체들의 농도를 측정하기 위한 분석법을 구축 이를 이용하여 글리세롤 이화 산물들의 농도를 체크함으로 S. cerevisiae내에서 GCY1 유전자가 미세호기 발효시 글리세롤 이화에 관여하는 것을 규명함.둘째, 글리세롤 이외에 5탄당 발효가 가능하도록 대사공학적으로 조작된 돌연변이 효모균주의 세포내 중추대사 경로상 대사체를 정량화하였음. 이를 위해서는 중추대사경로에 존재하는 대사물질의 정성 및 정량 분석이 필수적이기에 각 대사물질의 GC/MS에서의 대표피크를 확보한 후 표준그래프를 우선적으로 확립함.셋째, 2세대 바이오매스의 주된 구성성분 중 하나인 셀로바이오스를 발효할 수 있는 돌연변이 효모 균주를 확립하여 해당 돌연변이 균주의 내부 대사체를 분석 및 정량화함. 그 결과, 6탄당 글루코스 배지에서 배양한 경우와 비교하여 셀로바이오스 배지에서 배양된 경우, 트레할로오스 농도가 눈에 띄게 증가된 것을 확인함. 이에 활성산소에 대한 돌연변이 균주의 저항성을 확인함.넷째, 다양한 탄소원을 활용할 수 있는 효모 균주로부터 2-phenylethanol을 과합성시키기 위해 기질로 사용되는 페닐알라닌의 내부 농도를 대사체 분석을 통해 정량화하여 이를 바탕으로 대사공학적 접근을 통해 2-phenylethanol 생산을 위한 우량균주를 확보함.다섯째, 구축된 대사체분석법을 기반으로 동위원소를 이용한 대사체학 기반 대사흐름측정법을 GC/MS상에서 구현하고 효모 균주에서 대사 흐름을 측정함.
연구결과의 활용계획
시스템 생물공학은 전통적인 생물공학 분야의 한계를 극복하고 세포를 전반적이고 체계적으로 해석하여 생물공학 발전에 효율을 꾀하는 학문 분야임. 특히 산업균주를 대상으로 하는 대사체학 및 대사흐름 측정은 최근에 방법론이 확립되고 있는 기반기술임. 아직 태동기 학문인만큼 원천기술 확보가 가능하며, 전사체 등 다른 방법론과의 통합을 통해 새롭게 발전해 나갈 가능성이 높음. 본 연구에서 대사체학을 통해 개발된 돌연변이 균주들은 산업균주가 가지는 문제점 및 해결점을 제시할 수 있는 척도가 될 것으로 기대되며 산업균주로의 적용 또한 가능할 것임. 또한, 화석연료의 고갈과 온실가스 해결을 위한 바이오에너지 및 바이오화학 산업에서 핵심적 기술 중 하나인 균주개발에 적용함으로써 이 산업의 발전에 중요한 기술로 자리잡게 될 것임.

Abstract ▼

Purpose&contents
The purpose of this proposal is to establish experimental method for metabolite profiling and metabolic flux measurement for understanding metabolic regulations of industrial strains and to apply it to metabolic engineering for improving productivities and cellular properties of

Purpose&contents
The purpose of this proposal is to establish experimental method for metabolite profiling and metabolic flux measurement for understanding metabolic regulations of industrial strains and to apply it to metabolic engineering for improving productivities and cellular properties of industrial biotechnology. We established protocols for sampling, mass spectrometry analysis, quantification of metabolites, and non-stationary metabolic flux measurement and then applied them to measure intracellular metabolite concentrations and fluxes in Saccharomyces cerevisiae using glycerol or 5-carbon carbohydrates as carbon sources. Finally, we established a systems biotechnology method combining metabolomics and transcriptomics for metabolic engineering of industrial strains.
Result
First, the fast sampling system for metabolite profiling was developed to analyze the intracellular metabolites and identify the leaked metabolites in yeast. We also developed a GC/MS analyzing method for intracellular metabolites. With these two developed methods, we investigated by quantifying the glycerol and its dioxides by GC/MS that GCY1 is involved in a glycerol catabolism when S. cerevisiae is fermented in microaerobic condition. Second, we measured the concentration of metabolites in central metabolic pathway of mutant strain which was constructed for fermenting xylose. In order to accomplish this work, we set up the standard representative peak of each metabolite for qualitative and quantitative analyses by GC/MS.
Third, the cellobiose fermentable S. cerevisiae was constructed. We applied metabolite profiling method to characterize and improve this mutant strain as an industrial strain. We found the mutant strain accumulated considerable amount of trehalose in a cellobiose media compared to glucose media. As trehalose is reported as an antioxidant, the mutant showed improved resistance against the oxidative stress which is often produced during pretreatment of lignocellulosic biomass. Forth, an intracellular concentration of L-phenylalanine was detected with developed metabolite profiling method for construction of 2-phenylethanol overproducing yeast strain. we combined metabolite profiling result with metabolite engineering and successfully constructed a mutant strain for 2-phenylethanol production. Fifth, metabolite flux in yeast was computed with GC/MS data using 13C-labeled isotope.
Expected Contribution
Systems biotechnology is a field for overcoming limitation of conventional biotechnology methods by analyzing a strain globally and systematically. Especially, metabolomics and metabolic flux measurement of industrial strain are recently being developed. Because metabolomics is still at the early stage as a research field, there is higher chance to develop original technique or new method by combining with other tools, such as transcriptomics. Also, this technique can be directly applied to strain development for bioenergy or bio-based chemical industry, which are expected to solve problems in 21st century, such as depletion of fossil fuel or global warming.

목차 Contents

• 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
• 목차 ... 3
• 연구계획 요약문 ... 4
• 연구결과 요약문 ... 5
• 한글요약문 ... 5
• SUMMARY ... 6
• 연구내용 및 결과 ... 7
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 11
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 43
• 5. 연구결과의 활용 계획 ... 45
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 45
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 45
• 8. 참고문헌 ... 45
• 9. 연구성과 ... 46
• 10. 기타사항 ... 48
• 끝페이지 ... 54