초록 ▼

연구의 목적 및 내용
○ 본 연구의 목표는 beta-amyloid peptide(Aβ) 분해효소인 glutamate carboxypeptidase II(GCPII; FASEB, 2010)의 분자약리학적 이해를 높이고저 GCPII의 발현 조절에 관여하는 조절물질을 확인하며, 조절물질의 수용체를 동정하고, 조절 관련 기전 및 신호전달경로를 밝혀 GCPII의 발현에 중요한 조절점을 찾는 것임. 또한 GCPII의 발현 조절이 생체 내에서 Aβ 레벨을 조절하는지 검증하는 것이 본 과제의 목표임. 연구내용은 아래와 같음.
1차년도

연구의 목적 및 내용
○ 본 연구의 목표는 beta-amyloid peptide(Aβ) 분해효소인 glutamate carboxypeptidase II(GCPII; FASEB, 2010)의 분자약리학적 이해를 높이고저 GCPII의 발현 조절에 관여하는 조절물질을 확인하며, 조절물질의 수용체를 동정하고, 조절 관련 기전 및 신호전달경로를 밝혀 GCPII의 발현에 중요한 조절점을 찾는 것임. 또한 GCPII의 발현 조절이 생체 내에서 Aβ 레벨을 조절하는지 검증하는 것이 본 과제의 목표임. 연구내용은 아래와 같음.
1차년도 : GCPII의 발현 또는 활성을 조절하는 조절물질 확인
2차년도: 확인된 GCPII 발현을 조절하는 후보물질이 Aβ 양을 조절하는지 확인
3차년도: 확인된 조절 물질의 GCPII 발현조절 기전에 관여하는 수용체 동정과 조절기전 및 신호전달기전 확인
연구결과
○ 연구 내용 1: GCPII의 발현 또는 활성을 조절하는 조절물질 확인: GCPII 발현 조절인자로 prostate 암세포에서 NFTAc1이 알려져 있지만, 그 외에는 어떤 물질이 관여하는지 전혀 알려진 바 없음. 본과제의 연구 결과, HEK293 세포를 이용한 실험에서 세포내 칼슘 조절 물질인 inomycin에 의해 GCPII 단백질 레벨이 증가하였으나 mRNA 레벨에는 변화가 없었음. 그러나 신경세포 및 astrocyte에서 inomycin에 의한 GCPII 레벨은 HEK293 세포에서와는 달리 감소됨이 관찰되었고, H₂O₂, serum depletion의 세포 스트레스, LPS에 의한 염증 유발 시에도 GCPII 단백질 레벨이 감소되었음. Somatostatin만이 U87, H4, astrocyte에서 GCPII단백질의 레벨을 미약하게 증가시켰음. Valproic acid는 신경세포에서는 변화가 없었으나, astrocytes에서 단시간 처리 시(4-6 시간) GCPII 단백질 레벨을 증가시켰음. 따라서 valproic acid를 선발하여 astrocytes에서의 GCPII 발현 조절 기전을 연구하였음.
○ 연구내용 2: 확인된 GCPII 발현 조절물질이 GCPII의 발현을 조절함으로서 세포내 또는 세포밖의 Aβ peptide의 양을 조절하는지 확인: Swedish mutant/presenilin mutant가 과발현되어 Aβ를 다량으로 생산하는 H4, 293 HEK cells을 확립하였음. 이 세포주를 이용하여 ionomycin 처리한 후 GCPII 발현 증가가 세포내 Aβ의 양을 조절(감소)함을 확인함.
○ 연구내용 3: GCPII 발현 조절물질인 valproic acid의 GCPII의 발현 조절 기전에 관여하는 수용체를 확인하였고 관련 signaling pathway를 확인: Valproic acid의 타겟분자 (수용체)를 확인하기 위하여 U87 세포에서 Class I HDACs (HDAC1, 2, 3, and 8)과의 결합을 IP로 조사하여 HDAC1이 GCPII와 직접적으로 결합함을 확인함. 이는 HDAC1 mutant(deletion 1-50)이 GCPII와의 결합력이 감소되고 GCPII 아미노산 잔기에 아세틸화를 유도하는 미루어 확인되었음. 또한 Valproic acid는 GCPII의 lysine 잔기의 아세틸화를 증가시키고 ubiqutinylated GCPII를 감소시켰음. 따라서 valproic acid는 HDAC1을 저해하여 GCPII의 아세틸화를 증가시켜 ubiqutin/proteasome pathway 경로를 통해 매개되는 단백질 분해를 저해함으로써 GCPII stability를 증가시켜 단백질 양을 증가시킴을 확인함. 이러한 결과는 valproic acid가 지금까지 알려진 histone modification의 후생유전학적 발현 조절 기전 외에, HDAC을 매개하여 단백질을 직접적으로 acetylation화하여 stability를 증가하는 새로운 기전을 규명함.
연구결과의 활용계획
○ GCPII 단백질의 발현 조절물질로서 valproic acid를 확인하였고 valproic acid의 타겟단백질(수용체)로서 HDAC1을 확인하여, 치매치료제의 새로운 타겟으로서 HDAC1을 제시함.
○ Valproic acid는 조울치료제로 사용되고 있던 약물이므로 GCPII 발현이 우울증과도 관련이 있을 것으로 판단되어 이 분야로의 접목연구를 제시함
○ 또한 GCPII는 전림선암세포에서 발현이 매우 높아 질환마커 또는 PMSA (GCPII의 다른 이름)-targeted drug therapy의 tool로 이용되고 있음. 따라서 본 연구를 통해 확인한 GCPII의 acetylation에 의한 발현 조절이 전립선암에서의 역할을 이해하는데 기여할 것임

Abstract ▼

Purpose&contents
○ The purpose of the present study is to understand the molecular pharmacological characteristics of glutamate carboxypeptidase (GCPII) which was identified as a protease degrading beta-amyloid peptides(Aβs) in my laboratory (FASEB, 2010). Aβs are peptides well known to cause Alz

Purpose&contents
○ The purpose of the present study is to understand the molecular pharmacological characteristics of glutamate carboxypeptidase (GCPII) which was identified as a protease degrading beta-amyloid peptides(Aβs) in my laboratory (FASEB, 2010). Aβs are peptides well known to cause Alzheimer's disease. This study was aimed to identify molecules that increases the expression or activity of GCPII. In addition, the mechanism (or intracellular signaling pathways) involved in the candidate molecule-mediated increase of the GCPII protein level was planed in order to determine the regulatory points important for the GCPII expression.
Result
Content 1: Identification of an ionomycin and valproic acid as molecules stimulating the GCPII level.
○ The mechanism of GCPII expression is not well known, except that a transcription factor NFATAc1 is involved in prostate cancer cells. Our data demonstrated that ionomycin, an intracelllar Ca+inducer, increased GCP protein level without changes in mRNA in HEK293 cell. In contrast, ionomycin, other cellular stresses (H₂O₂, serum depletion), and LPS, reduced its protein level in neuronal and astocytes. Valproic acids enhanced increased the GCPII protein level in astrocytes, and not in neuronal cells. Thus we performed further studies how these molecules control GCPII expression.
Content 2: Examination of whether ionomycin is able to control the Aβ level through the increased GCPII expression
○ We set the H4, 293 HEK cells producing Aβ by over-expressing Swedish mutant/presenilin E9 deletion mutant. Using these cells we identified that ionomycin, increased expression of GCPII which resulted in decrease of Aβ level.
Content 3: Identification of the receptor for valproic acid and molecular regulatory mechanism involved in valproic acid-mediated GCPII expression
○ By immunoprecipitation experiment we identified HDAC1 among Class I HDACs (HDAC1, 2, 3, and 8) as a target molecule of valproic acid in U87 cells. We found that HDAC1 directly binds to GCPII. HDAC1 mutant (deletion1-50) showed the decreased affinity to GCPII and induced acetylation of GCPII. Furthermore, valproic acid increased acetylation of GCPII at lysine residues and decreased ubiquitylation of GCPII. Thus, treatment of valproic acid that inhibits the HDAC1 activity resulted in increase of GCPII acetylation (at lysine residues) which protects GCPII protein from ubiquitin/proteasome-mediated degradation pathway.
Expected Contribution
○ Identification of the endogenous molecule stimulating the GCPII protein level or activity will contribute our understanding of the pharmacological behavior of GCPII. The result from this study can be used in judging whether GCPII is a key molecule in controlling the Aβ level in brain.
○ If the activation of the molecule or receptor identified from this study reduces the Aβ level efficiently we may apply the agonist of the receptor for the AD drug development.
○ GCPII has been developed as a diagnostic drug for the prostate cancer or prostate membrane-specific antigen (PMSA; another name for GCPII)-targeted drug therapy. But there has been no data explaining how and why the expression of the PMSA is increased in prostate cancer cells. Thus this study will provide the basic information for those community working in this field.

목차 Contents

• 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
• 목 차 ... 3
• 연구계획 요약문 ... 4
• 연구결과 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 6
• 연구내용 및 결과 ... 7
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 13
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 16
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 33
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 34
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 34
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 37
• 8. 참고문헌 ... 37
• 9. 연구성과 ... 41
• 10. 기타사항 ... 42
• 끝페이지 ... 51