보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
과제시작연도 |
2014 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010252 |
과제고유번호 |
1395035928 |
사업명 |
차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500010252 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. 두과작물 식물시료 확보, powder library 제작 및 FT-IR 분석
- 고기능성 두과작물(콩, 녹두, 팥, 동부, 강낭콩, 완두)의 고속 선발 체계 확립 목표를 달성하기위하여 대두콩 150점, PLS 모델의 실제 검증을 위한 대두콩라인 451점, 녹두 153점, 팥 153점, 동부 153점, 강낭콩153점, 완두 42점을 확보하였다. 두과작물 시료들은 powder library를 제작하고 FT-IR 스펙트럼을 조사하여 스펙트럼 DB를 구축하였다.
2. 두과작물의 기능성 물질(플라보노이
Ⅳ. 연구개발결과
1. 두과작물 식물시료 확보, powder library 제작 및 FT-IR 분석
- 고기능성 두과작물(콩, 녹두, 팥, 동부, 강낭콩, 완두)의 고속 선발 체계 확립 목표를 달성하기위하여 대두콩 150점, PLS 모델의 실제 검증을 위한 대두콩라인 451점, 녹두 153점, 팥 153점, 동부 153점, 강낭콩153점, 완두 42점을 확보하였다. 두과작물 시료들은 powder library를 제작하고 FT-IR 스펙트럼을 조사하여 스펙트럼 DB를 구축하였다.
2. 두과작물의 기능성 물질(플라보노이드, 사포닌, 카로티노이드 계열) 정량 및 정성분석
- 대두콩 153점으로부터 UV-spectrum을 이용하여 total flavonoids 및 phenolics의 함량을 분석하였고 HPLC 분석을 통하여 isoflavone 성분별 함량을 정량분석하였다. isoflavone의 정량분석 결과, 대두콩에 존재하는 대표적인 isoflavone 성분으로 daidzein, genistein,glycitein, daidzin, genistin, glycitin, acetyldaidzin, acetylgenistin, acetylglycitin,malonyldaidzin, malonylgenistin, and malonylglycitin이 존재함을 알 수 있었다(도표 2, 그림 12). 팥 종자 시료에 존재하는 total flavonoids와 total phenolic compounds의 함량을 조사한 결과 총 124개 시료의 평균 함량은 각각 117.04 ± 6.45 ug/100mg dw, 4.2 ± 0.01ug/mg dw이었다. total flavonoids함량이 가장 높은 개체는 경남고성수집 라인, 청원봄팥라인이었으며 Total phenolic compounds 함량이 우수한 라인은 강원 춘천 수집라인이나 전남진도 수집라인으로 이들 품종을 이용하여 품종 선발이 이루어진다면 phenolic compounds 계열 화합물의 함량이 우수한 고기능성라인 팥 품종개발이 가능할 것으로 기대된다.
- 대두콩 유래 saponin 함량 예측 PLS 모델링 연구를 수행하기 위하여 대두콩 283종의 분말의 FT-IR과 HPLC 분석을 수행하였다. Group A saponin, group B saponin의 평균함량은 484.9 ㎍/g, 3670 ㎍/g이었으며 총 saponin 함량은 평균 4154.9 ㎍/g이었다(도표 5).
- 대두콩으로부터 UV-spectrum(도표 6)과 HPLC를 이용하여(그림 14, 도표 7) total carotenoids의 함량을 분석한 결과, 대두콩에 주로 존재하는 카로티노이드 성분은 lutein과 β-carotene이였으며, 나머지 성분들은 전체적으로 함량이 매우 낮았다(도표 7). 팥 종자에 존재하는 total carotenoids 함량을 조사한 결과 총 102개 시료의 평균 total carotenoids 함량은 약 2.9 ± 0.5 ug/g dw으로 flavonoids 및 anthocyanins에 비하여 팥 종자 내에 carotenoids 함량이 매우 낮음을 알 수 있었다(도표 8).
- GC 분석을 이용하여 대두콩에 존재하는 각 지방산 성분별 함량을 정량분석 하였다(그림15, 도표 9).
- 팥 종자에 존재하는 total anthocyanins 함량을 조사한 결과 총 124개 시료의 평균 total anthocyanins 함량은 약 5.73 ± 0.04 (A530-0.25*A657)/100mg dw이었다. Total anthocyanins 함량이 가장 높은 라인은 칠보팥, 충남재래 1호라인으로 이들 품종을 이용하여 품종 선발이 이루어진다면 total anthocyanins 고함유의 기능성 팥 품종개발이 가능할 것으로 기대된다.
3. 두과작물시료의 FT-IR 데이터로부터 기능성 물질 성분별 PLS 정량 예측 모델 개발 및 검증
가. 두과작물 식물로부터 isoflavone, sapoin, carotenid, fatty acids 및 total phenolics 함량 예측 PLS 모델링 개발 및 검증
- 대두콩 Total flavonoids, total phenolic 함량 데이터와 FT-IR 스펙트럼을 이용하여 PLS regression을 통해 예측 모델을 만들었다(그림 16). Total flavonoids, total phenolic content는 각각 0.44, 0.39의 상관계수를 나타냈다(그림 16A, B). 향후 FT-IR spectrum의 가공 조건 변화를 통하여 상관계수를 높일 수 있을 것으로 기대된다.
- HPLC 분석을 이용하여 isoflavone 성분별 정량 분석을 통해 대두콩이 함유하고 있는 총14종류의 isoflavone 성분들의 정량 분석을 수행하였다(도표 2). 이 데이터를 이용하여 FT-IR 스펙트럼 데이터를 기반으로 isoflavone 성분별 PLS regression한 결과 Malonyl-daidzin, Malonyl-genistin, Malonyl-glycitin, total isoflavone의 상관계수가 0.9이상으로 나타났다(그림 17). 이들 함량 예측 PLS 모델의 예측정확도를 검증하기 위하여 external validatoin을 수행한 결과 역시 상관계수가 0.8이상으로 나타나 정확도가 높은 예측이 가능함을 알 수 있었다.
- 대두콩의 saponin 성분별 정량 데이터와 FT-IR 스펙트럼을 이용하여 PLS regression을 실시한 결과 saponin Aa, TGA, TGB 그리고 TS의 상관계수가 0.7이상으로 나타났으며(그림20), external validation 결과 역시 saponin Ab, saponin bg, TGB 및 TS 함량예측 모델의 경우 예측치와 실측치의 상관계수가 모두 0.8 이상으로 나타나 대두콩으로부터 saponin 성분들의 함량 예측모델로 정확도가 높은 예측이 가능하였다.(그림 21).
- 대두콩의 total carotenoids와 carotenoid 성분들의 정량 데이터와 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 PLS regression을 실시한 결과, total carotenoids와의 상관계수가 0.69로 나타났고, lutein과의 상관계수는 0.998(그림 22A) β-carotene은 0.998로 나타났다(그림 22B). 하지만 external validation 결과는 lutein과 β-carotene함량예측 모델의 경우 예측치와 실측치의 상관계수가 모두 0.6 이하로 나타났는데 이 결과는 콩에 존재하는 carotenoid 계열 성분들의 함량이 매우 낮기 때문이라 사료된다.
- 대두콩의 fatty acids 성분 함량 예측 PLS regression 모델링을 개발한 결과 모두 높은 상관계수 값을 가져 calibration models의 예측 정확도가 높음을 알 수 있었다(그림 24). 실측검증 결과는 팔미틱산, 올레익산 그리고 리노레익산은 회귀분석 상관계수가 0.8 이상으로 높은 정확도를 보였으나 스테아릭산과 리노레닉산의 경우 상관계수가 0.7 이하로 상대적으로 예측 정확도가 낮음을 알 수 있었다.
- 팥 종자 시료로부터 기능성 물질들의 함량 예측 PLS 모델링 개발 및 검증을 실시한 결과,total flavonoids(그림 19), anthocyanins(그림 26), carotenoids(그림 27), 및 phenolic compounds(그림 28)의 PLS regression 모델링의 상관계수(R2)는 모두 0.9이상이었으며,external-validation을 수행한 결과 또한 상관계수(R2)는 0.8이상으로 PLS 모델링 단계에서는 물론 실질적으로 팥 종자 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 정확도가 높은 함량 예측이 가능한 체계를 확립하였다.
나. FT-IR 스펙트럼 가공조건 최적화를 통한 대두콩 기능성 성분 함량예측 PLS 모델링 정확도 향상
- 대두콩 FT-IR 스펙트럼 가공조건 최적화를 통하여 정확도가 높은 isoflavone, saponin,fatty acids 함량예측 PLS 모델링 체계를 확립하였다. 상기 PLS 모델링을 통한 external validation을 수행하여 10개 시료에서 함량예측과 실측검증을 수행한 결과 상관계수(R2)가 모두 0.8이상으로 나타나 함량예측 모델로서 활용 가능성이 매우 높음을 알 수 있었다.
4. 두과작물시료로부터 기능성 물질 고함유 라인 선발 및 대사체 수준 검증
가. 대두콩 기능성 성분 함량예측 PLS 모델링 실용화 검증
- 대두콩 종자 시료에 존재하는 total flavonoids 함량을 조사한 결과 총 382개 시료의 평균 total flavonoids 함량은 약 7.09 ± 0.02 ug/mg dw이었으며(도표 17) 이들 시료들 중 total flavonoids 함량이 우수한 라인인 GCS0097과 GCS0132 라인을 이용하여 품종 선발이 이루어진다면 flavonoid 계열 화합물의 함량이 우수한 고기능성라인 대두콩 품종개발이 가능할 것으로 기대된다.
- 대두콩 종자 시료로부터 total flavonoids 함량 예측 PLS 모델링 체계 확립하기 위하여 총382개 대두콩 종자시료로부터 얻어진 FT-IR 스펙트럼 데이터와 이들 시료의 total flavonoids 함량 데이터 사이의 PLS regression 모델링 분석을 수행하였다. PLS regression 분석을 통해 모델링의 상관계수(R) 0.800의 비교적 정확도가 높은 PLS 예측 모델링체계를 확립하였다(그림 30). 본 연구에서 개발된 total flavonoids 함량 예측 PLS 모델은 total flavonoids 고함유 콩 기능성라인 선발의 수단으로 활용이 가능할 것 것이며 향후 각flavonoid 계열 기능성 성분들의 고함유 콩 라인 선발 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
Abstract
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Leguminous plants are excellent sources of protein, dietary fiber, and various micronutrients and phytochemicals for human health. These metabolites in soybean seeds are important in human and animal nutrition. Plant metabolomics or metabolic profiling is an analytical approach that focuses on gener
Leguminous plants are excellent sources of protein, dietary fiber, and various micronutrients and phytochemicals for human health. These metabolites in soybean seeds are important in human and animal nutrition. Plant metabolomics or metabolic profiling is an analytical approach that focuses on generating the most comprehensive overview of metabolites present in plant tissue. These metabolic studies also play a pivotal role in crop breeding. Recently,spectroscopic techniques combined by multivariate statistical analysis are used for understanding and extracting biological information from the complex metabolic data sets. The great advantage of these techniques is they are simpler and more rapid due to the simplicity of sample preparation and analysis compared to chromatographic techniques, although their sensitivity is low. Furthermore, these techniques have been developed for simultaneous determination of useful compounds in food, agricultural products as well as whole plants. To date, much effort has gone of to the development of determination and prediction of nutraceutical compounds using near infra and infrared spectroscopic analysis including measurement of amino acid, flavonoids, phenolic compounds, lycopene and carotenoids in tomato and fatty acids from various agricultural products and organisms. However,the prediction model for nutraceutical compounds content from soybean seed has not been reported yet.To determine whether FT-IR spectroscopy combined with multivariate analysis for whole cell extracts can be used to discriminate major leguminous plant at metabolic level, seed extracts of six leguminous plants were subjected to Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). FT-IR spectral data from seed extracts were analyzed by principal component analysis (PCA), partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and hierarchical clustering analysis (HCA). The PCA could not fully discriminate six leguminous plants, however PLS-DA could successfully discriminate six leguminous plants. The hierarchical dendrogram based on PLS-DA separated the six leguminous plants into four branches. The first branch was consisted of all three Vigna species including Vigna radiata var. radiate, Vigna angularis var.angularis and Vigna unguiculata subsp. Unguiculata. Whereas Pisum sativum var. sativum, Glycine max L and Phaseolus vulgaris var. vulgaris were clustered into a separate branch respectively. The overall results showed that metabolic discrimination system were in accordance with known phylogenic taxonomy. Thus we suggested that the hierarchical dendrogram based on PLS-DA of FT-IR spectral data from seed extracts represented the most probable chemotaxonomical relationship between six leguminous plants.To examine the feasibility of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy for simultaneous determination of isoflavones, saponins, carotenoids and fatty acids contents in various soybean cultivars, total of 153 soybean (Glycine max Merrill) cultivars were subjected to FT-IR spectroscopy. Quantification of isoflavones, saponins, carotenoids and carotenoids contents from the soybean cultivars was confirmed by quantitative HPLC and GC analysis.The most significant spectral variations were observed in the amide region (1,700-1,500 cm-1),phosphodiester groups from nucleic acids and phospholipids (1,500 – 1,300 cm-1),and the carbohydrate region (1,200-1,000 cm-1) among commercial soybean lines.
Calibration models for isoflavone contents (daidzein, genistein, glycitein, and total isoflavones) were established by partial least squares (PLS) regression analysis, and validation of the method was performed according to the high-performance liquid chromatography (HPLC) chromatographic method. Spectral range as well as the number of PLS factors were optimized for the lowest root-mean-square error of prediction (RMSEP) and correlation coefficient of determination (R2). In cross-validation, malonyl-glucoside daidzin (RMSEP = 46.42, R2= 0.971),malonyl-glucoside genistin (RMSEP= 27.86, R2= 0.978), and malonyl-glucoside glycitin (RMSEP =7.56, R2= 0.972) were predicted with good accuracy. In external validation, malonyl-glucoside daidzin (R2= 0.845), malonyl-glucoside genistin (R2= 0.914), malonyl-glucoside glycitin (R2=0.814), and total isoflavones (R2= 0.916) were predicted with good accuracy, wheres prediction for glucoside daidzin (R2= 0.773), glucoside genistin (R2= 0.675), and glucoside glycitin (R2= 0.510) showed relatively lower accuracy. This study showed that FT-IR spectroscopy combined with multivariate calibration has significant potential for the quantitative analysis of isoflavone contents in commercial soybean cultivars.To determine the feasibility of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy for simultaneous determination of saponins contents in different soybean cultivars. In cross validation between predicted content of saponin by PLS regression modeling from FT-IR spectra and measured content by HPLC, saponin contents were predicted with good accuracy(R2≥ 0.71). In external validation, saponin group Ab (R2= 0.876), saponin DDMP-group βg(R2=0.846), total saponin group B (R2= 0.88) and total saponin content (R2= 0.87) were predicted with good accuracy, while prediction for saponin group Aa (R2= 0.58), saponin group Bb (R2= 0.72), and saponin group A (R2= 0.61) had relatively lower accuracy. Considering these results, we suggest that the PLS prediction system for saponin contents using FT-IR analysis could be applied as a novel screening tool for high yielding lines in soybean breeding.The quantitative prediction modeling of 5 individual fatty acids contents (palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid) from soybean cultivars were established using partial least square regression algorithm from FT-IR spectra. In cross validation, there were high correlations (R2 ≥ 0.97) between predicted content of 5 individual fatty acids by PLS regression modeling from FT-IR spectra and measured content by GC. In externalvalidation, palmitic acid (R2=0.8002), oleic acid (R2=0.8909) and linoleic acid (R2=0.815) were predicted with good accuracy, while prediction for stearic acid (R2=0.4598), linolenic acid (R2=0.6868) had relatively lower accuracy.We also conducted PLS regression analysis between FT-IR spectral data and the contents of total flavonoids and carotenoids from red bean cultivars. The regression coefficient (R2) between estimated and predicted values of total flavonoids and carotenoids was 0.99 and 0.99, respectively. At present, we are trying to confirm the accuracy of PLS prediction modeling using targeted metabolite analysis (GC-MS,LC-MS) of red bean lines. Considering the results of PLS regression modeling of isoflvones, saponins, and fatty acids contents, FT-IR in combination with multivariate analysis enables not only discrimination of metabolic variation between soybean seed lines but also prediction of isoflvones, saponins, and fatty acids contents from soybean seeds. Therefore, the prediction system of isoflvones, saponins, and fatty acids contents established in this study could be applied as a high throughput screening and selection system for high- yield lines in conventional breeding of soybeans.
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