보고서 정보
주관연구기관 |
양지푸드(주) |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2014-09 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011259 |
과제고유번호 |
1545006367 |
사업명 |
고부가가치식품기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011259 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1.저 알레르겐 장류제조를 위한 대두품종 및 증자조건 탐색
○ 대두의 증자 조건 설정
-증숙 공정은 Autoclave,121℃에서 10,20,30,40,50,60분 실행
-자숙 공정은 100℃,끓는 물에서 1,2,3,4,5,6시간 중탕 가열 처리
○ 증자 시료 채취 및 성분분석
- 장류제조용 적합 품종으로 추천되는 대풍,대원,태광의 3 품종,개척 2호(Kunitztrypsin inhibitor(KTI)및 Lypoxygenase결실 품종),CN628-15(1)(주요 대두 알레르겐인 T
Ⅳ. 연구개발결과
1.저 알레르겐 장류제조를 위한 대두품종 및 증자조건 탐색
○ 대두의 증자 조건 설정
-증숙 공정은 Autoclave,121℃에서 10,20,30,40,50,60분 실행
-자숙 공정은 100℃,끓는 물에서 1,2,3,4,5,6시간 중탕 가열 처리
○ 증자 시료 채취 및 성분분석
- 장류제조용 적합 품종으로 추천되는 대풍,대원,태광의 3 품종,개척 2호(Kunitztrypsin inhibitor(KTI)및 Lypoxygenase결실 품종),CN628-15(1)(주요 대두 알레르겐인 Trypsin inhibitor결실 품종),S-09(주요 대두 알레르겐인 Kunitz,β-conglycin의 α-subunit결실 품종),CN304-13의 4종 등 총 7종을 사용
-총질소 함량은 평균 41.13∼ 44.23%로 품종간 차이가 있음
-대두를 열처리하면 아미노태 질소 함량이 감소되는 경향을 보임
-주요 아미노산은 Val,Tyr,Phe,His등으로 나타났으며 열처리 조건에 따라 다양한 패턴으로 변화
○ 시판 장류제품의 알레르겐함량의 정성적 확인
-대부분의 시판장류 중에 10∼100kDa의 다양한 분자량의 단백질이 분포
2.대두의 품종 및 증자조건에 따른 항원성변화 규명
○ 장류용 대두의 항원성 조사
-대두 민감성 환자 혈청 내 콩에 대한 특이 IgE 수치가 30kU/L이상을 보인 환아 7명을 대상 Immunoblotting으로 알레르겐의 항원성 조사
-대두의 주요 항원으로 알려진 21kDa에서 양성을 나타낸 환자가 3명,34kDa에서 3명,43 kDa에서 4명,52 kDa에서 2명,72 kDa에서 양성을 나타낸 환자도 2명이었다.또한,혈중 IgE와 결합하는 단백질 성분은 환자에 따라 반응성을 보이는 성분의 차이가 있음
-Immunoblotting결과를 바탕으로 환자 혈청과 반응성이 컸던 단백질 밴드의 N-terminal아미노산 시퀀스를 확인하기 위해서 MALDI-TOF를 실시한 결과,대두의 주요 알레르겐으로 알려진 약 70 kDa의 β-conglycinin의 α-subunit으로 나타났고,다른 하나는 43 kDa의 glycinin으로 확인
○ 대두 민감성 환자 혈청을 이용한 자숙(삶기)및 증자조건에 따른 항원성 변화 확인
-대원과 CN304-13품종이 각각 3.145mg/ml,3.231mg/ml로 다른 품종에 비해 높은 단백질 함량을 보임
- 43kDa의 glycinin과 70kDa의 β-conglycinin의 α-subunit은 증숙 처리 시간에 따라 IgE 결합능이 감소하였지만 대부분의 품종에서 열처리만으로는 완전히 소실되지 않은 것으로 미루어 열 저항력을 가진 것으로 추측됨
-대부분의 대두 품종에서 자숙 처리 시간이 길어짐에 따라 IgE 결합능이 감소
-안전한 저 알레르기성 장류제품 제조를 위해서 대풍콩과 개척 2호 선발
3.대두 발효법에 따른 항원성변화 규명
○ 선발된 대두 및 증자 조건으로 대두 발효물 제조
-단일균을 이용한 단일 발효 뿐만 아니라,장류용 황국균(Aspergillusoryzae)으로 1단 발효 후 고초균(BacillussubtilisKCCM 11266P)으로 2단 발효시킴으로써 품종별 대두의 알레르기성 및 항원성 변화를 확인
○ 최적 증자 조건하에서 발효 균주를 달리한 장류 제조
-중성 protease활성은 2단 발효구에서 572~594unit/g으로 최대 활성을 나타냄
- 아미노태질소 함량은 발효함에 따라 점점 증가하여 대풍 품종의 경우 487.55~764.94mg%, 개척 2호의 경우 527.48~756.44mg%로 나타남
-2단 발효법으로 제조한 대두에서 다른 단일 발효구 보다 총 유리 아미노산이 높게 검출
○ 제조된 대두 발효물의 알레르겐 추출
-발효시간이 증가함에 따라 항원성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.특히 2단 발효시 단일 발효구에 비해 낮은 IgE level을 나타냄
4.대두 항원성 단백질의 특이항체 제조
○ 주요 대두 알레르겐의 재조합 단백질 생산
-대두 민감성 환자 혈청은 대두 단백질 9kDa,21kDa및 40kDa를 비롯하여 다양한 밴드와 반응하는 것을 확인하였으며 복숭아 단백질에 대해서는 9kDa와 반응
-항원성 단백질 LipidtransferproteinPrup3를 발현함
-재조합 단백질의 정제하여 대두의 난분해성 알레르겐인 LTP 검출을 위한 특이항체 제조에 사용
○ 항원성 단백질의 특이항체 제조
- 재조합 단백질 LTP Prup3을 정제하여 rabbit에 면역시켜 polyclonal항체 생산
○ 대두 알레르겐 특이항체의 역가 및 반응성 확인
- 발효대두에서 대두 품종,발효방법에 따른 LTP 함량의 변화를 효율적으로 검출하는 것을 확인
-대풍 품종이 개척 2호 보다 좀 더 낮은 LTP level을 나타냄
5.저 알레르겐 장류 제품 개발
○ 알레르겐 함량 측정을 위한 시판 청국장 및 된장의 시료 수집 및 항원성 단백질 추출
-시판 청국장,된장,고추장,쌈장을 수집하여 대두 민감성 환자 혈청을 이용하여 IgE 반응성을 조사한 결과 최적 증숙조건과 다단발효법을 거친 본 연구개발품에서 반응성이 낮은 수준으로 나타남
○ 확립된 최적 발효법을 적용한 저 알레르겐 장류 시제품 생산
- 저알레르기성 청국장 및 대두를 70℃에서 3일간 열풍건조하여 생산된 콩알메주를 이용한 된장을 시제품으로 생산
6.알레르겐 저감화 대두 발효 공정 확립
○ 효소면역분석법(ELISA)을 이용한 알레르겐 함량 측정
-시판 장류와 알레르겐 함량 비교 및 장류 시제품의 알레르겐 함량 측정
- LTP Prup3을 항원으로 하여 생산된 LTP 항체와의 반응성은 시판제품에 비해,본 연구 시제품에서 낮은 경향을 나타냄
○ 확립된 발효법으로 발효된 대두 발효물의 식품 소재화 시험
- 최적 발효법으로 생산한 대두 발효물을 70℃에서 3일간 열풍건조하여 생산된 건조 저알레르겐 대두는 3개월의 저장기간이 지난 후 에도 수분함량 및 미생물수 등의 품질에서 큰 변화가 없는 것으로 나타나 장기저장이 가능
-대두 발효물 추출물을 알레르기 유발성이 높은 타 식품원료(밀)에 처리한 결과 밀 알레르겐이 감소되는 경향을 나타내어,대두 발효물의 사용은 식품의 잠재적 알레르기 유발성을 감소시키는 가능성 발견
Abstract
▼
Ⅳ. Research and Development Result
1. Search of cooking condition and soybean varieties to produce low-allergen fermented soybean products
○ Establishment of soybean cooking condition
- The steaming process was implemented in 10, 20, 30, 40, 50, and 60 minute intervals at Autoclave, 121℃
Ⅳ. Research and Development Result
1. Search of cooking condition and soybean varieties to produce low-allergen fermented soybean products
○ Establishment of soybean cooking condition
- The steaming process was implemented in 10, 20, 30, 40, 50, and 60 minute intervals at Autoclave, 121℃
- The boiling process was implemented by heating in boiling water for 1, 2, 3, 4, 5, and 6 hoursat 100℃
○ Collection of cooking sample and analysis of ingredients
- The use of atotal of seven varieties was recommendedas varieties suitable to produce fermented products, including three varieties from Daepung, Daewon, and Taegwang, and fourvarietiesofGaechuk 2(variety producing Kunitztrypsin inhibitor(KTI)and Lypoxygenase), CN628-15(1) (variety producing Trypsin inhibitor, which is a main soybean allergen), S-09 (variety producing Kunitz, α-subunit ofβ-conglycin, a main soybean allergens), and CN304-13.
- The total nitrogen contents differed by an average of 41.13∼ 44.23% between varieties
- A tendency of reduced amino type nitrogen contents among the soybeans after heat processing of raw soybeans appeared
- The main amino acids appeared to be Val, Tyr, Phe, and His, which changed invarious patterns pursuant to the heat processing conditions
○ Quantitative confirmation of allergen contents offermented soybean products in the market
- Proteins indiverse molecular weight from 10~100 kDa appeared to be distributed among most of the fermented soybean products in the market
2.Investigation of antigenic change pursuant to cooking condition and variety of soybeans
○ Survey of antigenicity of soybeans for fermented products
- An antigenicity survey for allergen was conducted through Immunoblotting overs even minor patients showing a specific IgE level of 30 kU/L regarding beans within the serum of patients hypersensitive to soybeans
- There were three patients showing positive to 21k Da, amainantigen of soybean, three to 34k Da, four to 43k Da, two to 52k Da, and two to 72k Da. In addition, regarding the protein combined with IgE inblood, there were differences shown in reactivity based on the patient.
- Asa result of conducting MALDI-TOF in order to check the N-terminal amino acid sequence of a protein band, which had substantial reactivity with the serum of patients, based on the Immunoblotting result, it appeared to be α-subunit ofβ–conglycininin 70 kDa and glycininin 43k Da which are known as main types of allergen
○ Confirmation of antigenic change pursuant to cooking condition and boiling condition using the serum of patients hypersensitive to soybeans
- The varieties of Daewon and CN304-13 each showed 3.145 mg/ml and 3.231 mg/ml, showing a high protein content compared to other varieties.
- The glycinin in 43 kDa and α-subunit of β-conglycin in in 70 kDa showed lower combining power of IgE as the boiling processing time increased, however, considering the fact that complete destruction was not available only by heat processing in most varieties, it can bee stimated that the rewasheat resistance.
- The IgE combination ability reduced as the boiling process time increased in most of the soybean varieties.
- Gaechuk 2 and Daepung beans were selected to produce safe low-allergic fermented soybean productsx.
3. Investigation of antigenic change pursuant to soybean fermentation method
○ Manufacturing of soybean fermented products with the selected soybean and cooking method
- The change of antigenicity and allergic character of soybean pervariety was confirmed by fermenting with Aspergillusoryzae for fermented soybean products in the first stage and Bacillus subtilis KCCM 11266P in the second stage, in addition to fermenting by single stage process using as in glebacillus.
○ Production of fermented soybean products by differing the fermentation fungisunder the optimum cooking condition
- The neutral protease vitality appeared at its maximum with 572/594 unit/g at the second stage of fermentation.
-The aminotypenitrogen contents increased by the fermentation process, which showed 487.55~764.94mg% for the Daepung variety and 527.48~756.44mg% for Gaechuk 2.
- The total free amino acids produced from soybeans produced with the two-stage fermentation method appeared to be higher than other single fermenting sample.
○ Extraction of allergen from the produced fermented soybean product
- It could be confirmed that antigenicity decreased as the fermentation time increased. In particular, it showed a lower IgE when fermenting by two stages, compared to when having single fermenting sample.
4. Production of specific antibody of antigenic protein of soybeans
○ Production of recombined protein of main soybean allergen
- It was confirmed that serums of patients hypersensitive to soybean reacted with various bands, including soybean proteins 9k Da, 21k Da and 40k Da, and reacted with 9k Da regarding peach protein.
- Lipid transfer protein Prup 3, anantigenic protein, was revealed.
- Used to produce specific antibody to detect LTP, a non-degradable allergen of soybean by refining the recombined protein.
○ Manufacturing of specific antibody of antigenic protein
- Polyclonal antibody was produced by immunizing a rabbitby refining LTP Pru p3, a recombined protein.
○ Examination of reactivity and titer of distinctive antibody of soybean allergen
- The efficient detecting of the change of LPT content changed pursuant to the variety of soybean and fermentation method from the fermented soybean was confirmed.
- The Daepung variety showed alower LTP level compared to Gaechuk2.
5. Development of fermented soybean products with low allergen
○ Collection of samples of doenjang (soybean paste)to measure allergen contents and extraction of antigenic protein
- As a result of testing the reactivity of IgE by using the serum of patients hypersensitive to soybean by collecting specimen of rich soybean paste, soybean paste, red pepper paste, and processed soybean paste, the optimum steaming process and multiple stage fermentation method appeared to have low reactivity in the product under research and development here.
○ Production of specimen for fermented soybean product with low allergen applying the established optimum fermentation method
- Fermented soybean blocks were produced as specimen by drying low allergic rich soybean paste.
6. Establishment of allergen reduced soybean fermentation process
○ Allergen content measuring using ELISA method
- Contents of allergen contents and fermented soybean products on the market were compared and allergen contents of fermented soybean products on the market were measured.
- There activity to the LTP antigen produced by having LTP Prup 3as the antigen appeared to have a lower trend than the trial goods in this research, compared to products on the market.
○ Food materialization test of fermented soybean products through the established fermentation method
- The dry and low-allergen soybeans produced by drying the produced fermented soybean products through the optimum fermentation method using hot airforthreedaysat 70℃ appeared not to have a substantial change in quality, such as moisture content and number of microorganisms, even after the storage period of three months had passed, thus, long-term storage appeared to be available.
- As a result of handling the fermented soybean extracts with other food ingredients (wheat) with high likelihood of incurring allergy, a trend of reduced allergen appeared, thus, a possibility that using fermented soybean products may reduce the likelihood of potential allergy incurring character in food has beend is covered.
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