초록 ▼

Ⅴ. 연구개발결과
1. 제 1 세부과제
가. 인체 대사성 질환예방관련 전통발효식품의 균총 정보 분석
(1) 전통방식으로 제조 및 발효된 전통발효식품 8종(메주, 포기김치, 묵은지, 백김치, 깍두기, 새우젓, 멸치젓 및 조개젓)을 수집였음
(2) 수집된 샘플로부터 미생물학적 배양방법을 활용하여 총 1,589개의 균주를 분리 및 확보 하였음
(3) AP-PCR 및 DGGE 방법을 통하여 분석된 8가지 전통발효식품 내 발효균총을 비교한 결과 모든 전통발효식품으로부터 Lactobacillus, Bacillus,

Ⅴ. 연구개발결과
1. 제 1 세부과제
가. 인체 대사성 질환예방관련 전통발효식품의 균총 정보 분석
(1) 전통방식으로 제조 및 발효된 전통발효식품 8종(메주, 포기김치, 묵은지, 백김치, 깍두기, 새우젓, 멸치젓 및 조개젓)을 수집였음
(2) 수집된 샘플로부터 미생물학적 배양방법을 활용하여 총 1,589개의 균주를 분리 및 확보 하였음
(3) AP-PCR 및 DGGE 방법을 통하여 분석된 8가지 전통발효식품 내 발효균총을 비교한 결과 모든 전통발효식품으로부터 Lactobacillus, Bacillus, Leuconostoc, Weissella, Staphylococcus가 우점종으로 관찰되었음
나. 기능성 균주의 선별 및 기능성 유전자의 분자생물학적 탐색
(1) 분리된 발효미생물들을 대상으로 박테리오신 생산능 평가를 실시한 결과 전체 1,589 발효균주 중 13개의 균주가 nisin 보다 뛰어난 미생물억제활성을 보였음
(2) 선발된 균주들은 16S rRNA sequencing 방법으로 동정하였으며, 7종의 발효균주가 B.subtilis로 동정되었고 그 외에 B. licheniformis, L. plantarum 및 B. bifidum 으로 동정되었음
(3) 혈전용해능 기능성 평가를 통하여 전체 1.589 발효균주 중 혈전용해능이 강한 균주 15종을 선발하였음
(4) 16S rRNA sequencing 방법으로 동정한 결과 대부분 Staphylococcus였으며 그 외에
B. subtilis, L. mesenteroides, P. acnes 등으로 동정되었음
다. 축적된 기능성 유전체정보를 활용한 인체 대사성 질환관련 기능성 식품소재생산균주의 개발
(1) PCR 방법을 활용하여 선발된 균주 중 B. subtilis ZA400의 혈전용해능 유전자를 증폭한뒤 대장균 발현시스템으로의 클로닝을 실시하였음
(2) 대장균 발현시스템을 이용한 대량발현 후, stadard fibrin plate method를 통해 높은 혈전용해능을 확인하였음
(3) 이 혈전용해 효소(BsfA)는 SDS-PAGE/Western blotting을 이용하여 28.7kDa 크기를 가진 효소임을 밝힘
(4) 분리정제된 혈전 용해 효소는 온도(4~40℃), pH(6~10), Metal ion(Mn²⁺, Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺, Co²⁺) 및 inhibitor(EDTA, SDS)에서 안정하였음
(4) 또한 콩가루, 메주가루 배지에서는 20%의 높은 염농도까지 안정한 혈전용해능 활성이 나타남에 따라 비교적 염도가 높은 전통발효식품 내에서도 기능성을 유지할 수 있을 것으로 기대됨
라. 인체 대사성 질환예방관련 식품소재생산균주를 활용한 전통발효식품 시제품 제조
(1) 높은 혈전용해능을 가지는 기능성 미생물 B. subtilis ZA400, Bifidobacterium bifidum ZB193을 첨가하여 Lab-scale 수준에서 된장과 청국장을 제조하여 혈전용해 기능성을 확인하였음
(2) 이후 한식장류 전문업체를 통해 쩜장과 청국장을 Scale-up하여 시제품을 제작하였으며, 각각의 제품에서 비교적 안정적으로 유지되는 혈전용해 기능성을 확인하였음
2. 제 1 협동과제
가. 유전체 데이터베이스로부터 대사성 질환 예방효과 등 건강기능성이 있는 것으로 알려진 기존 전통발효미생물의 전체 염기서열을 확보함.
나. 전통발효식품으로부터 분리한 발효미생물의 Aflatoxin 생산 곰팡이(A. flavus)생장 억제능, proteinase, chitinase 및 hemolysis 활성의 역가분석을 통한 기능성 연구 수행 및 건강기능성 유전자 후보군의 선별을 수행함.
다. 전통 발효식품(된장, 젓갈)의 시기별 군집변화를 대용량 유전체 분석 기술 (pyrosequencing)을 이용하여 조사함으로서, 발효기간 중 주요하게 작용하는 유용 기능성 미생물 선정에 이용함.
라. 또한, 발효과정 중 대사체 분석을 통해 된장과 젓갈에 존재하는 인체 대사성 질환 예방 기능성 대사체의 규명을 진행함.
마. 상기 연구를 통해 선정한 젓갈류 우점종인 Salimicrobium jeotgali MJ3의 균주특성 및 유전체 분석을 통한 우수 기능성 유전자 발굴과 실제 발현 검증, 발현이 검증된 기능성 유전자들의 대사체 분석을 통한 인체 대사성 질환 예방 식품소재 생산 가능성을 검증함.
바. 된장으로부터 분리된 다수의 Bacillus의 기능성 평가를 통해 된장의 빠른 발효 유도와 병원성 세균, 진균의 억제 및 혈전을 분해할 수 있는 Bacillus methylotrophicus JJ-D34를 확보함.
사. 된장으로부터 분리된 Bacillus methylotrophicus JJ-D34의 유전체 분석을 통한 된장 내 고염환경 적응 및 인체대사성 질환예방 기능성 대사체 생성 기작 관련 유전자 정보를 확보함.
아. 신규 미생물 자원 확보 및 인체대사성 질환예방 기능성 균주 탐색을 위한 다수의 미생물 종을 분리하여 학계에 보고함.
3. 제 2 협동과제
가. 생물정보학 기술을 활용한 전통 발효식품 유래 기존 발효 미생물 유전체의 재해석
(1) 발효미생물 균주의 전유전체 데이터 재해석과 데이터베이스 구축을 위해 대상 발효미생물들을 주관기관의 연구 결과를 통해 결정함
(2) 주관연구기관의 1차년도 연구수행을 통해 Bacteriocin, Fibrinolysis의 기능성이 확인된 균주들의 taxonomic 정보를 획득
(3) 위 균주들 중 현재까지 NCBI (National Center of Biotechnology Information)의 database에 공개가 되어 있는 균주들을 다운받아 확보함
나. 재해석된 기존 발효미생물 유전체 정보를 바탕으로 한 발효미생물간의 비교유전체 분석
(1) Public 데이터베이스로부터 확보한 균주들의 분석을 위해 Average Nucleotide Identity(ANI) value를 이용한 genome tree를 그려 그들의 유사성 정도를 확인하였음
(2) genome tree를 그린 후 이들의 CDS들의 homology를 서로 비교한 후 이를 이용하여 전유전체의 차이점을 쉽게 볼 수 있는 Circos map을 그려 이들을 비교하였음
(3) 비교 유전체 분석을 통해 분석한 각 균주들의 CDS 차이점을 유전체 비교 테이블로 만들어 이들을 차후 비교유전체 데이터로 쉽게 활용할 수 있도록 저장한 뒤 형식을 바꾸었음
다. 비교유전체 분석 대상 균주들의 유전체 정보 DB 구축
(1) 1차년도 연구 결과로 주관연구기관에서 관찰한 기능성 발효미생물들 균주들의 이미 알려진 전 유전체 결과를 확보하여 이들의 전유전체 분석 결과와 비교유전체를 분석한 결과를 모두 모아 SQL 데이터베이스 표 형태로 구축하여 앞으로 구축할 데이터베이스를 위한 작업을 진행함
라. 발효미생물유래 확보된 기능성 유전자의 특성 및 대사분석을 위한 전사체/대사체 분석 결과의 DB 구축
(1) 전유전체 데이터베이스 구축을 위해 식품별 동정된 균주들의 정보를 1 협동기관의 결과로부터 획득함
(2) 동정 균주들 중 현재까지 NCBI (National Center of Biotechnology Information)의 database에 공개가 되어 있는 균주들을 다운 받아 확보하고 DB화함
(3) NCBI로부터 확보한 균주들의 전유전체를 향상된 생물정보학적 기법을 이용하여 재분석하여 CLG file 형태로 데이터 추가 분석 가능 하도록 구축함
마. DB화 된 분석 결과와 기존의 전사체/대사체 비교분석 및 그 결과의 DB화
(1) 전사체/대사체 데이터베이스 구축을 위해 1협동기관으로부터 발효미생물 유래 데이터를 확보하였음
(2) 전사체/대사체의 데이터베이스화를 위해 SQL table을 구축하였음
바. 전통발효식품내 식품별 주요 발효 미생물 종류 및 구성을 파악하기 위한 기존 메타지노믹스 결과를 바탕으로 비교 분석
(1) NCBI 에 공개되어 있는 전통 발효식품 관련 총 5개의 연구 문헌에 사용된 143개의 메타지놈의 시퀀싱 데이터 확보
(2) 확보된 전통 발효식품의 메타지놈 시퀀싱 데이터를 분석하여 메타지놈에 존재하는 미생물 군집 정보 획득
(3) 데이터베이스에 통합 및 시각화 위해 미생물 군집 정보를 규격화
사. 각 식품별 메타지놈 데이터를 비교하여 주요 미생물 종류와 구성에 대한 데이터 축적 및 메타지놈 DB 구축
(1) 메타지놈 데이터베이스를 구축하기 위해 제 1 협동 기관으로부터 멸치젓 52 샘플의 메 타지놈의 군집 분석 결과를 획득
(2) NCBI 공개된 전통식품에 존재하는 메타지놈의 구성 정보를 제 1 협동기관의 데이터와 함께 관계형 데이터베이스에 통합
아. 전통 발효식품 유래 기능성 식품 소재 생산 균주의 대사체/유전체 정보의 통합 및 DB 구축
(1) NCBI SRA에 공개된 발효미생물 전사체의 NGS 시퀀싱 데이터 확보
(2) 기능성 발효 미생물의 유전체, 전사체 및 발효 식품의 메타지놈 데이터를 얻을 수 있는 통합 데이터베이스를 구축
(3) 통합된 데이터베이스를 기반으로 jQuery +JAVA/JSP+dHTMLx+MySQL 기반의 연구자용 홈페이지를 구축 (http://www.korfermfood.com)
(4) 전통 발효 식품별, 발효 미생물별, 데이터베이스 및 연구 성과 및 관련 논문 등을 찾을수 있는 페이지 구성 및 전통 발효식품에 관련된 유전체, 전사체 및 메타지놈의 연구 결과를 시각화 하고 다운로드 받을 수 있는 메뉴 구성
(5) Biomarker 발굴 프로그램인 LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size)를 이용하여 두 종류의 서로 다른 전통 발효 식품의 메타지놈 구성을 비교 할 수 있는 기능을 구현하여 시각화한 결과를 제공

Abstract ▼

This study aims at the development of functional food material-producing strain using omics information of fermenting bacteria from Korean traditionally fermented foods for alleviation of human metabolic syndrome. To conduct this study, eight Korean traditionally fermented foods were collected and a

This study aims at the development of functional food material-producing strain using omics information of fermenting bacteria from Korean traditionally fermented foods for alleviation of human metabolic syndrome. To conduct this study, eight Korean traditionally fermented foods were collected and about 1,589 fermenting acteria were isolated from them. AP-PCR/DGGE/16S rRNA sequencing were used for omposition analysis of microbiota in the fermented foods. In addition, antibacterial and fibrinolytic activities were monitored in the isolated fermenting bacteria, showing that about 20% fermenting bacteria have these activities. Among them, B. subtilis ZA400 showed the highest fibrinolytic activity and this strain was selected for further molecular gene expression of a fibrinolytic enzyme (BsfA) and applied for development of a new type fermented food with high fibrinolytic activity. Furthermore, changes of fermenting microbiota in Korean traditionally fermented foods (jeotgal and meju/doenjang) during fermentation were monitored using metagenomics and metabolomics. Functional analysis of fermenting bacteria in jeotgal showed high growth inhibition activity against A. flavus producing aflatoxin. Among major fermenting acteria in jeotgal and doenjang, S. jeotgali MJ3 and B. methylotrophicus YJ11-1-4 were studied to understand human metabolic syndrome-associated functions in omics level. From these studies, omics data were collected and the related database was constructed. For comparative analysis, fermenting bacteria and various microbiota information were collected and deposited into the DB. Based on the collected information of this study and previously reported omics information in the DB, comparative genomics and metagenomics were conducted and the results were also deposited into the DB. Finally, all the analyzed data are present in the DB and available to the public. The study results and the related DB would be useful for further application and development of various functional fermented foods.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 10
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 12
• 제1장 연구개발과제의 개요 및 성과목표 ... 13
• 제1절 연구과제의 배경 ... 13
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 15
• 제3절 연구성과 목표 대비 실적 ... 17
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 제1절 국내외 기술 현황 ... 18
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제1절 제 1세부과제 ... 20
• 제2절 제 1협동과제 ... 85
• 제3절 제 2협동과제 ... 135
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 156
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 160
• 제1절 연구개발의 성과 ... 160
• 제2절 성과활용 계획 ... 164
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 166
• 제7장 연구시설․장비 현황 ... 166
• 제8장 연구실 안전관리 이행실적 ... 167
• 제1절 연구활동종사자 안전교육 실시 ... 167
• 제2절 실험실 안전 점검 실시 ... 168
• 제3절 실험실 안전사고 대응 및 예방 ... 168
• 제9장 참고문헌 ... 169
• 첨부 :특허, 논문, 제품(시장) 분석보고서 ... 172
• 끝페이지 ... 176