[보고서]핵산조절 기술을 이용한 난치성 질환치료제 개발

김주항

보고서 정보

주관연구기관

연세대학교 산학협력단

연구책임자

김주항

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2015-04

과제시작연도

2014

주관부처

산업통상자원부
Ministry of Trade, Industry and Energy

연구관리전문기관

한국산업기술평가관리원
Korea Evaluation Institute of Industrial Technology

등록번호

TRKO201600017418

과제고유번호

1415134672

사업명

바이오의료기기산업핵심기술개발사업

DB 구축일자

2017-09-20

키워드

C형간염바이러스 치료제.리피도이드 전달체.난치성 비소세포폐암.오스테오폰틴.siRNA 항바이러스제.종양선택적 아데노바이러스.흑색종.면역치료 내성극복.siRNA.carrier.

표 Multimeric siRNA
표 면역치료내성 극복형 항암핵산치료제 개발
표 Aptamer-siRNA chimeric RNA 타겟 및 전달단계
표 HA 복합체외 siRNA 탑재 모식도
표 Aptamer-siRNA 복합체의 타겟 및 작용 모식도
표 siRNA/HA 유도체 complex의 세포 및 동물 실험 평가 모식도
표 HCV 복제가 가능 한 영장류 및 설치류 동물 에서의 PRK2 유전자 구 조.
표 (A) PRK2 유전자 개요 및 siRNA 타겟 부위. (B) siRNA를 간암세포주인 Huh7에 서 HCV가 복제되고 있는 R-1 세포주(HCV 구조단백질이 결손 된 HCV subgenome를 지닌 stable 세포주)에 lipofectamin RNA iMAX를 사용하여 전달한 뒤 48시간 뒤 PRK2의 발현정도 (B) 및 HCV 유전자 카피수를 Western blot 및 real-time PCR로 각각 분석 함(C).
표 PRK2 siRNA의 특이적 항-HCV 효능
표 세포주기를 FACS로 분석하고 HCV IRES에 의해 luciferase reporter가 발현되는 assay reporter를 사용하여 각각 분석한 결과 PRK2 특이적 siRNA(PRK2-1)가 세포주기 (A) 및 HCVIRES-의존적 단백질 합성 (B)에 영향을 미치지 않음을 볼 수 있었음
표 HCV 복제효소와 PRK2의 특이적 binding 분석. PRK1과 PRK2에 대한 특이적 항체로 이들 단백질을 각각 면역침강 후 이와 같이 결합하여 HCV 복제효소인 NS5B단백질이 침강되는 지는 Western blot으로 분석한 결과
표 HCV 감염세포주 에서의 PRK2 siRNA의 항바이러스 효능 분 석
표 HCV subgenomic replicon이 복제되고 있는 Huh7 간암세포주에 PRK2-1 siRNA를 lipofectamin RNA iMax 혹은 리피도이드 ND98을 사용 하여 10 nM 최종농도로 전달한 결과 48시간 뒤 50%정도의 HCV 복제억 제 효과를 나타냄을 볼 수 있었음
표 신규 타겟에 대한 siRNA의 항-HCV 효능을 10 nM 농도로 lipofectamine을 사용하여 전달 후 분석 함
표 분리된 쥐 간세포에 electroporation으로 GFP 발 현벡터를 도입하고 collagen coating된 plate에서 배양 후 형광현미경으로 이미지를 분석 한 결과.
표 (좌측) 인간 간 세포주(Huh-7)에서 신규 리피도이드의 세포 독성 평가. (siRNA를 전달하지 않은 세포주의 미토콘드리아 활성도 대비 % 비율로 표현).(우측) 기존 리피도이드(ND98, NA110, NA114)와 신규 리피도이드 (C12-SPM, C12-SPD, C12-PUT, C12-CAD)를 이용한 siRNA 전달(100 nM siRNA, 리피도이드:siRNA = 5:1) 후 측정된 세포 활성도 (siRNA transfection 후 2일째 측정).
표 (좌측) 기존 리피도이드와 신규 리피도이드를 이용한 siRNA 전달(25 nM siRNA, 리피도이드:siRNA = 5:1) 후 측정된 GAPDH 활성 감소. (우측) 50 nM siRNA 전달 후(리피도이드;siRNA = 5:1) 측정된 GAPDH 활성 감소. siRNA transfection 후 2일째 측정
표 선별된 리피도이드(ND98, NA114, C12-SPM)를 이용하여 인간 간세포주(Huh-7) 내로 PRK2 siRNA 전달한 후 측정된 PRK2 발현양 비교(50 nM siRNA, siRNA 전달 후 2일째 측정).
표 생체 내로의 siRNA 전달을 위한 리피도이드 기반 리포좀 제형.
표 생체 전달용 리피도이드(ND98) 제형을 이용한 리포터(luciferase) 단백질 전달
표 리피도이드(ND98)를 이용하여 소동물 모델 (쥐)의 간 조직으로 PRK2 siRNA를 전달한 후 측정된 PRK2 발현양 비교(siRNA 투여량; 5 mg/kg body weight, siRNA 전달 후 2일째 측정).
표 (A) PRK2 유전자 개요 및 siRNA 타겟 부위. (B) siRNA를 간암세포주인 Huh7에서 HCV 가 복제되고 있는 R-1 세포주(HCV 구조단백질이 결손된 HCV subgenome을 지닌 stable 세포주)에 lipofectamin RNA iMAX를 사용하여 PRK2 타겟 siRNA를 각각 10 nM 최종 농도로 전달한 뒤 48 시간 뒤 PRK2의 발현정도 및 HCV NS5B 발현양 을 Western blot으로 분석한 결과임.
표 HCV 복제 세포주 에서의 PRK2 siRNA의 항바이러스 효능 분석.
표 Huh7 간암 세포주에 PRK2-1 siRNA를 lipofectamin RNA iMax(좌측) 혹은 그림에 표시한 1차 선 별된 전달능이 우수한 리피도이드(ND98, C12-SPM)를 사용하여 PRK2 siRNA의 리포터 발현 억제효과를 분석함. 비특이적 siRNA인 scrambled siRNA를 전달한 대조군 및 mock 대조군과 비교 시 리포터 발현을 50-80% 억제함을 볼 수 있었음(우측).
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA. (A) HCV IRES 구조 및 염기서열. 하단에는 HCV 유전형 2a 및 1b에서 모두 염기서열이 보존이 되어 있는 부분을 보여주고 있음. (B) HCV 염기서열이 가장 잘 보존 되어 있는 부위에 대한 HCV IRES 타겟팅 siRNA 라이브러리 구축. 디자인한 siRNA 및 타겟 부위
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효능 분석
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA siIE22의 IC50 결정
표 분리된 쥐 간세포에 electroporation으로 GFP 발현벡터를 도입하고 collagen coating된 plate에서 배양 후 형광현미경으로 이미지를 분석한 결과. 분리된 간세포는 in vitro에서 증식은 되지 않으나 지속적으로 GFP 형광을 2주간 유지함으로 볼 수 있었음. 이미지는 transfection 후 5일 및 8일째 세포
표 분리된 마우스 primary hepatocyte를 2주 이상 세포배양하며 간세포기능이 유지되고 있는지 확인하 기 위해 albumin 생산여부와(좌측) 간세포 특이적 전사인자인 HNF3beta 발현을(우측) RT-PCR로 분석한 결과 인간간암세포주인 Huh7과 이로부터 유래한 HCV subgenmic replicon를 함유하고 있는 stable cell line R1 보다 마우스 primay hepatocyte에서 이들의 발현이 현저히 높음을 볼 수 있었음. 분리된 간세포가 정상적 기능을 유지하고 있음을 보여주는 결과 임.
표 리피도이드 ND98로 mouse primary hepatocyte에 도입된 PRK2 siRNA의 타겟 유전자 발현 억제 효능 평가.
표 리피도이드의 마우스 hepatocyte로의 siPRK2-1 전달효능 분석 결과.
표 마우스 간에 전달된 siIE22에 의한 리포터 유전자 발현 억제 효과 분석 결과
표 마우스 xenograft 모델에서 PRK2 활성억제 제 HA1077의 항-HCV 효능 분석 결과
표 마우스 xenograft 모델에서 siPRK2-1의 항-HCV효능 분석
표 인간 PBMC와 HEK293 인터페론 베타 프 로모터 활성 에세이용 벡터를 도입 후 처리한 siRNA 나 double strand RNA인 polyI:C에 의한 선천성 면 역반응 유도분석 결과.
표 선별된 siRNA의 인터페론 알파 발현 유도 분석. Balb/c 마우 스(n=4)에 siE22, scrambled siRNA(SC), HCV 3
표 리피도이드 유도체(C12-SPM)와 siRNA의 복합체 형성 확인(전기영동분석)
표 C12-SPM 유도체를 이용한 형광물질 (Cy3)로 표지된 siRNA 전달 이미징 분석
표 (좌측) C12-SPM을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 인간 간세포주 (Huh-7) 내 PRK2 발현 측정을 위한 정량적 PCR 분석 (siRNA 전달 후 2일째에 측정). (우측) C12-SPM을 이용하여 PRK2 siRNA를 HCV subgenome 보유 인간 간세포주(R1) 내로 전달한 후 관찰된 HCV 복제 감소(siRNA 전달 후 2일째에 측정).
표 C12-SPM에 탑재된 PRK2 siRNA 마우스 정맥 투여 후 2일 째 측정 된 PRK2 발현 정량적 분석. (좌측) 전체 간 조직 내 PRK2 발현. (우측) 관류 방식 으로 분리된 간세포 내 PRK2 발현.
표 리피도이드 유도체(ND98)와 siRNA의 복합체 형성 확인(전기영동분석).
표 ND98 유도체를 이용한 형광물질(FAM)로 표지된 siRNA 전달 이미징 분석
표 (좌측) ND98을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 인간 간세포주(Huh-7) 내 PRK2 발현 측정을 위한 정량적 PCR 분석(siRNA 전달 후 2일째에 측정). (우측) ND98을 이용하여 PRK2 siRNA를 HCV subgenome 보유 인간 간세포주(R1) 내로 전달한 후 관찰된 HCV 복제 감소(siRNA 전달 후 2일째에 측정).
표 ND98에 탑재된 PRK2 siRNA 마우스 정 맥 투여 후 2일 째 측정된 PRK2 발현 정량적 분석. (좌측) 전체 간 조직 내 PRK2 발현. (우측) 관류 방식으로 분리된 간세포 내 PRK2 발현.
표 간세포로의 특이적, 효율적 siRNA 전달을 위한 C12-SPM 유도체 개량(간세포 표면의 수용체 에 결합할 수 있는 galactose 당쇄를 C12-SPM 리 포좀 제형에 도입함).
표 Galactose가 표적리간드로 도입된 C12-SPM 리피도이드 유도체를 이용하여 인간 간세포주 내로 PRK2 siRNA 전달 후 2일째에 수행된 PRK2 발현 정 량적 PCR 분석.
표 (A) siRNA/ND98 복합체에 사용되는 lipidoid ND98의 구조. (B) HCV subgenomic replicon이 복 제되고 있는 R-1 세포주에 10 nM 농도로 siPRK2-1 처리시 항바이러스를 분석한 결과. (C) 선별된 siRNA 의 인터페론 베타 발현 유도 분석
표 siRNA의 안정성(stability) 향상과 면역반응유도를 억제하기 위한 수식구조.
표 (A) 50% 혈청에서 siPRK2-1의 안정성 분석. (B) 수식화 된 siRNA선별을 위한 50% 혈청에서의 안 정성 분석.
표 siPRK2-1와 수식화 된 siPRK2-1의 HCV 복제 억제 효능 비교 평가.
표 (A) 50% 혈청에서 siIE22의 안정성 분석. (B) 수식 화 된 siRNA선별을 위한 50% 혈청에서의 안정성 분석
표 siIE22와 수식화 된 siIE22의 HCV 복제 억제 효능 비교 평가.
표 Xenograft model 에서의 HCV 복제 억제 효능 평가
표 Xenograft model에서 바이러스가 안정적으로 혈청 내에 유지됨을 확인 함(그림 D 좌측), PRK2 활성억제제인 HA1077(fasudil)을 투여하여 항바이러스 효능을 분석(그림 D 우측)
표 Xenograft model에서의 siPRK2-1의 항바이 러스 효능을 분석.
표 (A) Xenograft model에서 수식화된 siPRK2-1의 항바이러스 효능 평가. (B) Xenograft model에서 ND98/liposome으로 싸여진 siRNA가 대부분 간에 가있음을 확인.
표 (좌측) HCV IRES 구조 및 염기서열. 표시된 부분은 siIE22의 타게팅 부분.(우측) HCV IRES 타겟팅 siRNA siIE22의 IC50 결정
표 (A 와 B) 마우스 in vivo 모델에서 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효과를 보기위한 타임 테이블과 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효과를 마우스 in vivo 모델에서 분석하기 위한 dual luciferase reporter 구조. (C) 마우스 간에 전달된 siIE22에 의한 리포터 유전자 발현 억제 효과 분석 결과.
표 (A) Xenograft model에서 수식 화 된 siIE22의 항바이러스 효능 평가. (B) Xenograft model에서 ND98/liposome으로 싸여진 siRNA가 대부분 간에 가있음을 확 인.
표 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 당 리간드로 수식된 리피도이드 제형
표 당으로 수식된 리피도이드 리포좀 제형의 TEM 및 파티클 크기 측정을 위한 DLS 분석.
표 당으로 수식된 리피도이드 제형 (C12-SPM-PG, C12-SPM-PL)과 일반 제형 (C12-SPM)의 간세포 내로의 PRK2 siRNA 전달 효율 분석. PRK2 siRNA transfection 2일 후 PRK2 발현 측정을 위한 정량적 PCR 분석을 실시.
표 형광물질로 표지된 siRNA를 포함 한 리피도이드(C12-SPM) 제형의 정맥 투여 후 조직별 형광 분포 LIVE 이미징 분석(투여 후 2시간에 측정).
표 리피도이드(C12-SPM) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 생체 내 전달(마우스 모델). 정맥 투여 후 2일째 수거된 간세포 내 PRK2 발현을 조사하기 위한 정량적 PCR 분석.
표 siRNA의 안정성(stability)향상과 간으로의 전달을 위한 서열 수식.
표 (좌측) 위의 23가지의 서열을 reporter를 지닌 HCV subgenome이 안정적으로 복제되고 있는 세포주에서 항 -HCV 효능을 100 pM에서 분석. (우측) 그림 2 왼쪽 그래프에서 선별된 서열을 HCV subgenome이 복제되고 있는 R-1 세포주에서 항-HCV 효능을 10 nM에서 분석.
표 수식된 siRNA의 혈청 내에서의 안정성을 평가 함. 선별된 서열을 45% 혈청에서 1시간 30 분 동안 반응시킨 후 Northern blot하여 수식하지 않은 서열보다 안정성이 향상된 서열을 선별함
표 합성한 siRNA 목록
표 Passenger strand에 수식되어 있는 선별된 서열에 PS수식을 guide strand에 도입.
표 그림 5의 서열을 HCV subgenome이 복제되고 있는 R-1 세포주에서 항바이러스 효능을 1 nM에서 분석
표 그림 6에서 항바이러스 효능이 좋은 것을 선별해 혈청에서 안정성을 평가함. 45% 혈청에서 시간별로 반응 후 EtBr staining으로 서열의 잔존량을 확인함
표 HCV IRES를 지닌 reporter를 마우스 간에 전달한 후 siIE22(No.26) iposome 제형을 1 mg/kg 용량으로 정맥주사 하고 16시간 뒤 전달된 siRNA의 리포터 유전자 발현 억제 효과를 uciferase assay로 분석 함.
표 (좌측) 전달체 없이 naked 서열을 5 mg/kg 용량으로 정맥주사 후 20분 뒤 전달된 siRNA의 guide strand의 카피수는 Taqman probe를 사용한 real-time qRT-PCR로 분석함
표 PS 수식된 siIE22를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft모델)에 꼬리 정맥을 통 해 3일 간격으로 1 mg/kg 농도로 주입. 주입 후 2일 뒤 혈 청에 남아있는 HCV RNA 카피수는 Taqman probe를 사용 한 real-time qRT-PCR로 분석함. CTRL(n=5)는 비처리군
표 PS 수식된 siPRK2를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft모델)에 꼬리 정맥을 통해 3일 간 격으로 3 mg/kg 농도로 주입. 주입 후 2일 뒤 혈청에 남아있는 HCV RNA 카피수는 Taqman probe를 사용한 real-time qRT-PCR로 분석함. CTRL(n=5)는 비처리군
표 간세포 표면 수용체에 결합 할 수 있는 당쇄 리간드로 수식된 리 피도이드(C12-SPM) 제형의 모식도 및 크기/형태를 분석하기 위한 DLS, TEM 분석.
표 Galactose 당쇄로 수식된 리피도이드(C12-SPM-PG) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 간 조직 내 siRNA 의 존재를 검증하기 위한 northern blot 분석(당쇄로 수식되지 않은 C12-SPM 제형과 비교).
표 HCV xenograft 마우스 모델에 C12-SPM 기반 리피도이드-PRK2 siRNA 제형을 주입하는 프로토콜.
표 리피도이드(C12-SPM) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 생체 내 전달(HCV xenograft 마우스 모델) 후 혈액 내 HCV titer를 정량하기 위한 PCR 분석
표 간암세포 이식 미우스의 해부학적 분석. (A) 정상마우스의 간 조직. (B) 간암 세포주 Huh7이식 8주후 간 조직.
표 간암세포 이식 마우스에서 human albumin이 검출되는 지를 ELISA로 분석 한 결과.
표 감암세포가 이식된 마우스에 HCV(2x109 copies/ml)를 200 μl(4x108 copies) tail vein injection하여 감염시 키고 2주간 혈청내 HCV RNA titer를 분석한 결과, 간암세포가 이식된 마우스에서 HCV 복제가 일어남을 확인함.
표 감암세포가 주입 후 splenectomy로 spleen를 절제하는 수술 과정
표 간조직에 직접 이식된 인간간세포를 지닌 마우스 모델에서 HCV의 복제정도를 분석한 결과 10^5 - 10^6copies/ml 의 HCV 게놈이 혈청에서 검출됨을 확인 할 수 있었음.-
표 Expsome으로 도입 된 gs_PS1 siIE22의 항바이러스 효능 분석 결과.
표 Lipidoid stock solution의 제조
표 C형 간염바이러스 IRES 타겟팅하는 siIE22와 이전에 보고되어진 서열들
표 HCV 게놈에 Renilla 루시퍼레이즈 리포터 유전자 가 삽입되어 복제에 따라 루시퍼레이즈 활성이 증가하는 replicon을 사용하여 Somagenics사의 서열들의 항바이러 스 효능을 비교 평가함
표 C형간염바이러스 서브 게놈이 안정적으로 복제되고 있는 R-1 세포주에서 Xavier University의 서열들(Xi_316-334, Xi_si321) 및 Tokyo Metropolitan Institute 의 서열(TK_9.10)과 gs_PS1 siIE22와의 항바이러스 효능을 qRT-PCR 분석법으로 비교 평가함
표 면역 침강법으로 얻어진 Ago2 복합체를 이용하여 Somagenics사의 HCVc-wt siRNA와 PS 수식화 된 siIE22와 수식화 되지 않은 siIE22의 타겟 RNA의 절단능력을 비교 평가하였음
표 (A) 그림5와 같은 방식으로 면역침강으로 회수한 Ago2 복합체를 사용하여 타겟 절단능을 비교한 결과. (B) siIE22 타 겟으로 부터 각각 5‘(siIE21) 및 3’(siIE23) 방향으로 2개 뉴클 레오타이드씩 guide-strand의 타겟이 이동된 siRNA들을 추가 로 포함하여 Ago2 재조합단백질을 사용한 타겟 절단 시험을 수 행한 결과. RNA 타겟으로는 동위원소로 표식 된 HCV 서열 1-487번을 사용함
표 siIE21.5, siIE22, siIE22.5를 45% 혈장과 섞은 후 37℃에서 반응시킴. 30분 및 60분 뒤 잔존하는 siRNA의 guide strand의 량을 Northern blot 분석을 하여 처리 시간 0분에 대한 상대치로 표시함.
표 C형간염바이러스 IRES를 지닌 reporter를 마우스 간 에 전달한 후 siIE22 LNP를 0.1 mg, 1 mg/kg 용량으로 정맥 주사 하고 16시간 뒤 전달된 siRNA의 리포터 유전자 발현 억 제 효과를 luciferase assay로 분석함
표 siIE22 LNP으로 제형한 후 인간의 간세포로 치환된 마우스(PhoenixBio)에 꼬리정맥을 통해 3일 간격으로 2회 1 mg/kg 농도로 주입. 주입 후 매일 몸무게와 혈청에 존재하는 알부민의 농도를 분석함. 화살표는 siIE22 LNP를 주입한 시 점.
표 siIE22 LNP의 PK분석 결과
표 1차년도 시스템 구성도
표 GDM-SPE (PEA) 합성 도식
표 GTA-SPE PEA와 Folate-GTA-SPE (F-PEA) 합성 도식
표 Gal-PEG-PEA (GPP) 합성 도식
표 Gal-PEA (GP) 합성 도식
표 폴리아미노산/PEG/폴리아민 합성 도식
표 Tf-폴리아미노산/PEG/폴리아민 합성 도식
표 2차년도 시스템 구성도
표 3차년도 시스템 구성도
표 GPCS의 합성 scheme 및 합성된 복합체의 1H NMR 을 통한 확인
표 GPCS/pDNA 중합체의 물리화학적 특성조사 (a) 전기 영동, (b) 전자현미경, (c) DLS, (d) Zeta potential
표 GPCS의 (1) HepG2, (2) A549, (3) HeLa 에서의 세포독성 (a) MTS assay, (b) LDH release assay
표 GPCS의 간세포 특이적 전달효율의 확인 (a) GPCS 와 PCS의 비교 (b) 간암세포 (HepG2)와 폐암세포 (A549)의 비교
표 실제 mouse를 이용한 간에서의 GPCS/GFP의 발현 (a) CLSM을 통한 GFP 형광 확인 (b) H&E 염색을 통한 간에 서의 독성여부 확인
표 간암모델마우스 H-ras12V에서 GPCS/Pdcd4의 항 암효과 관찰 (a) 간에서의 GFP 전달 확인 (b) Western blot을 통한 간에서의 PDCD4 발현양 확 인 (c) tumor counting을 통한 항암효과 확인
표 Gal-CHI-g-SPE(GCS) 합성도
표 GCS의 물리화학적 특성조사 (a) 전기영동 (b) DLS (c) TEM (d) Protection assay (e) zeta potential
표 MTS를 이용한 세포독성 (a) HepG2 (b) A549 (c) HeLa
표 GCS의 간세포 특이적 유전자 전 달효율 평가
표 간으로의 GCS/GFP 전달효율 (a) control (b) vector control (c) GFP only (d) GCS/GFP (e) Chi-g-SPE
표 SDA/bPEI600의 합성 scheme
표 SDA/bPEI600의 1H-NMR 분석 였음
표 SDA/bPEI600와 siRNA 복합체형성여부 확인
표 RNaseA를 이용한 유전자 보호능력 확인
표 A549 암세포주에서 시간대별, 농도별 세포생존율 확인
표 치료유전자 복합체 주사 후 tumor 크기 변화
표 치료유전자 복합체 주사 4주 후 tumor 무게
표 치료유전자 복합체 주사 4주 경과 후 tumor 크기
표 용혈성 시험
표 혈소판 활성 시험
표 4차년도 시스템 구성도
표 SDA/bPEI600와 siRNA 복합체 형성 확인.
표 유전자 보호 능력 확인.
표 구형의 응축된 나노입자 형성 확인.
표 H460 세포주에서의 복합체의 전달 효율 확인.
표 siOPN 투여 후 체중 변화.
표 siOPN 투여 후 종양 부피의 변화.
표 부검일에 적출한 종양 무게.
표 부검일에 측정한 종양 부피.
표 siOPN 복합체 투여 후 부검일에 적출한 종양의 비교.
표 적출한 종양조직에서 RNA 수준의 OPN 발현량 비교.
표 면역염색법을 통한 종양조직의 OPN 발현량 비교.
표 siOPN 투여 후 종양부피의 변화.
표 부검일에 적출한 종양 부피의 비교.
표 siOPN 복합체 투여 후 부검일에 적출한 종양의 비교
표 용매결정 시험.
표 5차년도 시스템 구성도
표 랫드와 비글견에 대한 28일 반복투여 독성시험의 CRI-1309 농도
표 CRI-1309의 정맥투여 독성연구의 요약
표 적출한 종양조직에서 오스테오폰틴 단백질의 발현 비교
표 CRI-1309의 랫드 단회 정맥 투여 후 약동학 파라미터의 정리
표 CRI-1309의 비글견에 대한 28일 독성시험의 연구 계획
표 CRI-1309의 비글견에 대한 28일 정맥 반복 투여 독성(2회/주)시험의 독성동태학 요약
표 CRI-1309의 SD랫드에 대한 호흡기계에 미치는 영향평가 연구 계획
표 비글견에 대한 CRI-1309의 28일 독성시험의 연구 계획
표 랫드에 대한 CRI-1309의 국소내성 연구 계획
표 랫드에 대한 CRI-1309의 국소내성 시험 결과
표 국내 항암제 개발 현황
표 국내 개발 항암제 신약
표 항암제 세계시장 규모 및 예측
표 siRNA 치료제의 예상되는 세계 연간 수익 지표
표 현재 개발중인 siRNA 치료제들의 표적 질병들
표 Polycistron-based shRNA expression plasmid
표 GX-03 (인간형) 구조
표 1단계 dl324-BstBI-△E3-U6-shFoxP3-H1-shTGFβ2 제작
표 2단계 dl324-3484-△E1B-GMCSF-IRES-DCN-△E3-U6-shFoxP3-H1-shTGFβ2 제작
표 pCA14-3484-CMV-△E1B-mGMCSF-IRES-mDCN 셔틀벡터 제작
표 셔틀벡터에서 마우스 GM-CSF와 데코린의 발현확인
표 네가지 마우스 유전자를 발현하는 아데노바이러스 및 플라즈미드에서 TGF-β2와 FoxP3 mRNA 발현저하
표 네가지 마우스 유전자를 발현하는 아데노바이러스에서 GM-CSF와 decorin 분비확인
표 dl324-Bstb I-ΔE3-U6-shFoxp3-H1-shTGF-b2에서의 상동재조합 확인
표 dl324-3484-△E1B-hGMCSF-IRES-hDCN-△E3-U6-shhFoxp3-H1-shhTGF-β2 제작
표 dl324-3484-△E1B-hGMCSF-IRES-hDCN-△E3-ΔE3-U6-shFoxp3-H1-shTGF-β2에 서의 상동재조합 확인
표 네가지 인간 유전자를 발현하는 아데노바이러스에서 TGF-β2와 FoxP3 mRNA 발현저하
표 네 가지 인간 유전자를 발현하는 아데노바이러스에서 GM-CSF와 decorin 분비확인
표 마우스의 면역유전자와 shRNA 발현하는 종양선택적 아데노바이러스에 의한 항종양 효과
표 사람의 면역유전자와 shRNA 발현하는 종양선택적 아데노바이러스에 의한 항종양 효과
표 GX-03에 의한 in vitro 면역증강 효과
표 마우스의 면역유전자와 shRNA 발현하는 종양선택적 아데노바이러스 감염된 종양형성마우스에서의 in vitro 면역증강 효과
표 GX-03에 생성된 유효성분에 의한 in vitro 면역증강 효과
표 마우스의 면역유전자와 shRNA 발현하는 종양선택적 아데노바이러스에 생성된 유효성분에 의한 in vitro 면역증강 효과
표 마우스에 형성된 종양에 마우스 4m 유전자 발현하는 종양선택적 아데노바이러스 감염후 종양조직내의 면역세포 조직화학염색
표 마우스 유전자가 포함된 다양한 조합의 종양선택적 바이러스에 의한 항종양효과
표 사람과 마우스의 GX-03 감염에 의한 GM-CSF 발현확인
표 사람과 마우스의 GX-03 감염에 의한 데코린 발현확인
표 사람 GX-03 감염에 의한 FoxP3 발현억제확인
표 사람과 마우스 GX-03 감염에 의한 FoxP3 발현억제확인
표 GX-03 아데노바이러스 확인
표 GX-03 완제의약품의 제조 뱃치 설명
표 GX-03 완제의약품의 물리화학적 특성 분석
표 ARM 표준액 분석 결과 (위)GX-03-FF-001 (아래) GX-03-1401)
표 GX-03 완제의약품함량분석 결과 (위) GX-03-FF-001 (아래) GX-03-1401) 결과
표 GX-03 완제의약품의 각 염기 개수
표 PCR 증폭 region
표 GX-03 특이적인 PCR 증폭 결과 (위) GX-03-FF-001 (아래) GX-03-1401) 결과
표 GX-03 완제의약품의 생물학적 특성 분석 결과
표 GX-03 완제의약품 용량의존적 TGFβ2 발현량 감소
표 GX-03 완제의약품의 감염성 확인 (위)GX-03-FF-001 (아래) GX-03-1401)
표 Primer set 실시간 정량 PCR 결과
표 실시간 정량 PCR 결과 (Ct value)
표 종양 조직 DNA 첨가 후, primer set 실시간 정량 PCR 결과
표 종양 조직 DNA 첨가 후, primer set 실시간 정량 PCR 결과
표 주요 장기 및 전혈 total DNA를 이용한 실시간 정량 PCR 결과
표 GX-03 단회 투여 PK/ADME 시험 계획
표 단회 투여 후, 종양 lysate의 mGM-CSF 발현량 확인
표 단회 투여 후, 종양 내 실시간 정량 PCR 결과
표 단회 투여 후, 혈액 내 실시간 정량 PCR 결과
표 단회 투여 후, 주요 장기 내 실시간 정량 PCR 결과
표 GX-03 반복 투여 PK/ADME 시험 계획
표 반복 투여 후, 종양 lysate의 mGM-CSF 발현량 확인
표 반복 투여 후, 종양 내 실시간 정량 PCR 결과
표 반복 투여 후, 혈액 내 실시간 정량 PCR 결과
표 반복 투여 후, 주요 장기 내 실시간 정량 PCR 결과
표 GX-03 원료의약품 임상시료 GMP 제조 조직도
표 GMP 임상시료 제조
표 GX-03 완제의약품 바이알 및 카톤
표 Amgen사의 T-VEC 면역치료제의 연도별 예상 매출 규모
표 항암 면역치료제 경쟁 제품 대비 GX-03의 경쟁 우위성
표 개발 후보 물질 GX-03의 사업화를 위한 연구·개발 계획

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