초록
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1. 연구목표
핵과 미토콘드리아를 경유하는 종양억제인자 p73 의 암세포 사멸 경로에서 중요한 항암 작용점인 p73-MDM2 및 p73-Bcl-2 계 단백질 결합의 기전을 분자적 수준에서 규명함으로써 암세포사멸에서 세포 내 lo...

1. 연구목표
핵과 미토콘드리아를 경유하는 종양억제인자 p73 의 암세포 사멸 경로에서 중요한 항암 작용점인 p73-MDM2 및 p73-Bcl-2 계 단백질 결합의 기전을 분자적 수준에서 규명함으로써 암세포사멸에서 세포 내 localization 에 따라 상이한 p73 의 이중적 역할에 관한 분자 모델을 정립하고 이에 근거하여 암세포 사멸을 유도하는 새로운 p73 기반 암 치료 전략을 도출하고자 함.

2. 연구방법
- NMR 기반 chemical shift perturbation (CSP) 분석 기법을 이용하여 p73 transactivation domain (p73TAD) 의 MDM2 및 Bcl-2 계 단백질 결합 측정 및 결합부위 mapping
- p73TAD 펩타이드 돌연변이, ITC 기반 결합 친화도 분석 및 CD, NMR 기반 구조 분석을 통해 p73TAD 의 인산화와 MDM2 및 Bcl-2 계 단백질 간 상관관계 분석
- 면역침전법 및 GST pull-down assay 방법을 이용하여 p73TAD 의 새로운 Bcl-2 계 단백질 결합 발굴 및 검증
- NMR 방법을 이용하여 p73TAD-MDM2 및 p73TAD-Bcl-XL 단백질 복합체의 용액상 삼차구조 규명
- Cell viability assay, DNA fragmentation assay 등 세포 기반 실험 및 구조기반 mutagenesis 실험을 통해 암세포 사멸 활성을 유도하는 p73TAD 부위 규명.

3. 연구결과
(1) 핵 경유 세포사멸 경로에서 p73 의 MDM2 단백질 결합 기전 규명
- NMR 방법의 CSP 분석을 통한 p73TAD-MDM2 단백질 간 결합부위를 삼차구조상에서 mapping 수행하였음.
- ITC 기반 결합 친화도 분석 및 CD, NMR 기반 구조 분석을 통해 p73TAD 인산화, p73TAD 구조 및 MDM2 결합 간 상관관계 분석하여 p73TAD 의 인산화는 MDM2 결합을 저해함을 규명하였음.
- NMR 분광법으로 p73TAD-MDM2 복합체의 용액상 삼차구조를 규명하고 구조 기반 mutagenesis 를 통해 MDM2 결합에 중요한 p73TAD 잔기를 발굴하였음.

(2) 미토콘드리아 세포사멸 경로에서 p73 의 Bcl-2 계 단백질 결합 기전 규명
- NMR 기반 스크리닝, 면역침전법 및 GST pull-down assay 에 의해 p73 과 결합하는 Bcl-2계 세포사멸 저해인자 3종 (Bcl-XL, Bcl-2, Bcl-w) 를 새롭게 발굴하고 검증하였음.
- NMR 방법의 CSP 분석을 통해 p73TAD 과 Bcl-2 및 Bcl-XL 간 결합부위를 삼차구조상에서 mapping 하고 ITC 를 이용하여 야생형과 돌연변이 p73TAD 펩타이드의 결합 친화도를 분석 하였음.
- NMR 분광법에 의해 p73TAD-Bcl-XL 단백질 복합체의 용액상 삼차구조를 규명하고 구조 기반 mutagenesis 을 통해 Bcl-XL 결합에 중요한 p73TAD 잔기를 발굴하였음.

(3) 암세포 사멸에서 p73 의 이중적 역할에 관한 분자 모델 정립 및 신규 암 치료 전략 도출
- Cell viability assay, cytochrome c release assay 등 세포 기반 실험을 통해 Bcl-XL 결합이 p73 의 세포사멸 활성에 끼치는 효과 분석한 결과 p73 의 미토콘드리아 세포사멸 활성이 Bcl-2 계 단백질에 의해 조절되는 지를 규명하였음.
- 암세포 사멸 활성 측정을 통해 p73 의 암세포 사멸 활성 유도 부위로서 p73TAD (10-25번잔기) 부위를 규명하였음.
- p73-MDM2 및 p73-Bcl-2 계 단백질 결합 기전을 비교분석하여 암세포 사멸에서 세포 내 localization 에 따라 상이한 p73 의 이중적 역할에 관한 분자모델을 정립하고 이를 응용하여 암세포 사멸을 유도하는 신규 p73 기반 암치료 전략을 도출하였음.

( 출처 : 요약문 4p )

Abstract
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1. Purpose
In this study, we aim to construct a molecular model for dual role of p73 in cancer cell death within different cell...

1. Purpose
In this study, we aim to construct a molecular model for dual role of p73 in cancer cell death within different cellular compartments and develop a novel p73-based cancer therapeutic strategy by elucidating a molecular basis for the binding mechanism of p73 with MDM2 and Bcl-2 family proteins.

2. Method
- Measurements and binding site mapping for the interaction of p73 transactivation domain(p73TAD) with MDM2 and Bcl-2 family proteins by using NMR-based chemical shift perturbation (CSP) analysis
- Analysis of correlation between p73TAD phosphorylation and its binding to MDM2 and Bcl-XL by mutagenesis of p73TAD peptide, ITC measurements of binding affinity, and CD and NMR-based structure analysis
- Identification and validation of novel Bcl-2 family protein binding of p73TAD by using immunoprecipitation and GST pull-down assays.
- Determination of solution structures of p73TAD-MDM2 and p73TAD-Bcl-XL complexes by using NMR spectroscopy.
- Identification of apoptosis-inducing p73TAD peptide motif by cell viability assay, DNA fragmentation assay and structure-based mutagenesis.

3. Results
(1) Determination of MDM2-binding mechanism of p73 on nuclear apoptotic pathway
- Mapping of p73TAD-MDM2 binding interface at the three-dimensional level by NMR-based CSP analysis
- The ITC-based binding affinity and CD and NMR-based structural analyses elucidating the correlation among p73TAD phosphorylation, p73TAD structure, and MDM binding, revealing that p73TAD phosphorylation inhibits p73TAD-MDM2 binding.
- Determination of the three-dimensional solution structures of the p73TAD-MDM2 complexes by using NMR spectroscopy and identification of p73TAD residues critical for MDM2 binding by structure-based mutagenesis.

(2) Determination of Bcl-2 family protein-binding mechanism of p73 on mitochondrial apoptotic pathway
- Identification of novel interactions of p73 with anti-apoptotic 3 Bcl-2 family proteins(Bcl-XL, Bcl-2, and Bcl-w) by NMR-based screening and GST pull-down assays
- Mapping of p73TAD-Bcl-XL binding interface by NMR-based CSP analysis and measurement of the binding affinity of Bcl-XL with wild-type and mutant p73TAD peptides by using ITC
- Determination of the three-dimensional solution structures of the p73TAD-Bcl-XL complexes by using NMR spectroscopy and identification of p73TAD residues critical for Bcl-XL binding by structure-based mutagenesis

(3) Construction of dual role of p73 in cancer cell death and novel anticancer therapeutic strategy
- Analysis of effect of Bcl-XL binding on p73-mediated apoptosis activity revealed that mitochondrial apoptotic activity of p73 is regulated by interaction between p73 and Bcl-2 family proteins
- Identification of cancer cell death-inducing p73TAD (residues 10-26) by cell-based assays
- Construction of a molecular model for the dual role of p73 in cancer cell death by comparing binding mechanisms between p73-MDM2 and p73-Bcl-XL and development of a novel p73-based cancer therapy

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차
Contents
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• 표지 ... 1제 출 문 ... 2목차 ... 3요약문 ... 4Project Summery ... 61. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8 (1) 연구배경 및 필요성 ... 8 (2) 연구개발대상 기술의 국내․외 현황 ... 14 (3) 연구목적 ... 15 (4) 연구범위 ... 162. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 16 (1) 연구대상 ... 163. 연구과제의 연구개발결과 ... 18 (1) p73 의 MDM2 단백질 결합 기전 규명 (핵 경유 세포사멸 경로) ... 18 (2) p73 의 Bcl-2 계 단백질 결합 기전 규명 (미토콘드리아 세포사멸 경로) ... 27 (3) p73 과 Bcl-2 계 단백질 간 결합 부위 규명 및 결합 친화도 분석 ... 30 (3) 암세포 사멸에서 p73 의 이중적 역할에 관한 분자모델 정립 및 p73 기반 암 치료 전략도출 ... 344. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 40 (1) p53 family 단백질들의 MDM2 결합 기전 비교 ... 40 (2) p73TAD 와 Bcl-계 단백질 간 새로운 결합 기전 규명 ... 41 (3) 암세포 사멸에서 p73 의 이중적 역할 규명 ... 425. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 45 (1) 연구성과 총괄 ... 45 (2) 연구성과 상세내역 ... 46 (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 566. 연구과제의 활용계획 ... 57 (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 57 (2) 연구성과의 활용계획 ... 577. 참고문헌 ... 598. 첨부서류 ... 63끝페이지 ... 71

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참고문헌

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