초록 ▼

본 연구팀은 지난 5년간의 연구수행을 통하여 연구팀이 보유하고 있던 2D 간세포 분화방법을 3D 입체 분화 시스템으로 전환하고 최적화 하는데 성공함으로써 기존 대비 분화 수율 측면에서 3배이상, 그리고 약물대사 기능 측면에서 2배 이상의 양적, 질적 향상에 성공하였음. 또한 분화과정 중 전구세포 및 최종분화 단계 두 단계에 걸쳐 간세포만을 순수하게 정제할 수 있는 화합물을 개발함으로써 최종 획득한 간세포의 순도를 95%이상으로 향상시키는데 성공하였음. 더불어 분화중인 간세포를 획득한 뒤 이를 3차원적으로 집합시킴과 동시에 간세포 집

본 연구팀은 지난 5년간의 연구수행을 통하여 연구팀이 보유하고 있던 2D 간세포 분화방법을 3D 입체 분화 시스템으로 전환하고 최적화 하는데 성공함으로써 기존 대비 분화 수율 측면에서 3배이상, 그리고 약물대사 기능 측면에서 2배 이상의 양적, 질적 향상에 성공하였음. 또한 분화과정 중 전구세포 및 최종분화 단계 두 단계에 걸쳐 간세포만을 순수하게 정제할 수 있는 화합물을 개발함으로써 최종 획득한 간세포의 순도를 95%이상으로 향상시키는데 성공하였음. 더불어 분화중인 간세포를 획득한 뒤 이를 3차원적으로 집합시킴과 동시에 간세포 집합체 (3D 스페로이드)의 크기를 균일화 하는 방법을 개발하여, 동일한 직경의 분화 간세포 스페로이드를 다량으로 획득 가능한 기술을 개발하였음. 생산된 간세포 스페로이드를 최종 성숙단계에서 약물에 반복 노출 시킴으로서 주요 약물대사 효소의 발현 및 활성을 높일 수 있는 기법 역시 개발하였으며 간세포 스페로이드를 타 세부과제에 연구재료로 공급함.

정량적으로 논문 11편 (목표치 5), 특허출원 5건 (목표치 2), 특허등록 3건 (목표치 1) 등 목표치 이상의 성과를 도출하였으며“고기능성 간세포의 분화방법” 및 “간세포의 약물대사 기능향상방법”을 포함하여 확보한 특허들을 기업에 기술이전 “(기술료 4억 징수완료)”함으로서 실질적인 사업화에 성공하였음.

( 출처 : 보고서 요약서 3p )

Abstract ▼

Purpose & Contents
The purpose of this project is to develop the 3-D spheroid differentiation protocol for generating a large number of hepatocytes from hESCs to be applicable for preclinical predictive drug toxicity test

● To develop an protocol to produce hepatocytes with high drug metab

Purpose & Contents
The purpose of this project is to develop the 3-D spheroid differentiation protocol for generating a large number of hepatocytes from hESCs to be applicable for preclinical predictive drug toxicity test

● To develop an protocol to produce hepatocytes with high drug metabolizing activities suitable for drug hepatotoxicity test
● To establish a basic "user-friendly culture system" for a stable maintenance of hepatic function
● To apply the established differentiation protocol for in vitro toxicity system and optimize the protocol for a final platform of an ideal in vitro toxicity screening system

1) Optimization of 3-D differentiation protocol for generating hepatocytes from hESCs
○ Development of differentiation processes for the production hepatic spheroids using 3-D culture of hepatoblasts derived from hESCs
○ Discovery and treatment of factors promoting drug metabolizing phase I & II enzymes
○ Enhancement of drug metabolizing activities of hepatocytes by differentiating 3-D hepatic spheroids

2) Comparative Analysis of hepatic features and functions of 3-D hepatic spheroid with normal primary heptocytes
○ Comparative analysis of gene/protein expressions between hESC-derived hepatic spheroids and primary hepatic cells and tissues
○ Verification of physiological and biochemical functions of hESC-derived 3-D hepatic spheroids
○ Analysis of transcriptional regulatory module of hESC-derived 3-D hepatic spheroids.

3) Intensive analysis of drug metabolizing activities
○ Comparative analysis for cytochrome P450 and conjugating enzymes of hepatic spheroid derived from different hESC lines
○ Expression analyses of drug absorption and excretion-related plasma membrane transporters
○ Comparative analysis of drug metabolizing activities between 2-D and 3-D hepatic differentiations

4) Optimization and standardization of the differentiation protocol for an application to a highly efficient in vitro drug toxicity system
○ Optimization of differentiation and culture conditions for applying to cell-chip and toxicity test systems.
○ Development of culture conditions to maintain hepatic functions in vitro toxicity test systems.
○ Validation for the practical values of hESC-derived hepatocyte-based in vitro drug toxicity test system

Results
Manufacturing of 3D hepatic spheroids and improvement of drug metabolizing activity

○ Achievement #1: Improvement of yield and maturity for hepatic differentiation
Succeeded in the development of the differentiation protocol for generating functional human hepatocytes that includes the steps of amplifying the number of hepatic progenitors, maintaining HNF4α expression, and purifying hepatic cells.

○ Achievement #2: Generation of 3D hepatic spheroids from human PSCs
Succeeded in the generation of same-sized hepatic spheroid from differentiating human PSCs using the spherofilm mold and comparative characterization of hepatic spheroids with different sizes (300~600 um) to choose the optimal size of hepatic spheroids.

○ Achievement #3: Enhancement of drug-metabolizing activity of spheroids
Characterization of drug-metabolizing activities of hepatic 3D spheroids compared to 2D-cultured hepatocytes and demonstration of the enhancement of drug-metabolizing activities of major CYP enzymes in hepatic spheroids by multiple exposures to drugs during the final differentiation stage of human PSCs.

○ Achievement #4: Commercialization of the project
Technology transfer of the patents involving the project to the company in Oct 2016 and commercialization of the hepatocyte produced from the protocol of project for the shipment to China government institute according to the export contract.

Expected Contribution
○ The patents involving the above achievements have been transferred to a company. Thus, together with the company, our team will continuously develop and produce the 2^nd generation products of human stem cell-derived hepatocytes for domestic demands and export. In addition, together with KIT, we’ll continuously develop the HTS/HCS drug toxicity screening system using hepatocytes produced by the project.

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 8
• 목차 ... 9
• 제1장. 연구개발과제의 개요 ... 10
• 1절. 연구개발 목적 ... 10
• 2절. 연구개발의 필요성 ... 10
• 3절. 연구개발 범위 ... 17
• 제2장. 국내외 기술 개발 현황 ... 18
• 1절. 세계적 수준 ... 18
• 2절. 국내수준 ... 19
• 3절. 국내외 연구현황 ... 20
• 제3장. 연구 수행 내용 및 성과 ... 23
• 1절. 1차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 23
• 2절. 2차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 31
• 3절. 3차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 43
• 4절. 4차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 59
• 5절. 5차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 76
• 제4장. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 85
• 1절. 연구개발의 최종목표 ... 93
• 2절. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 93
• 3절. 계획대비 달성도(선정 시 제시된 연구목표) ... 95
• 4절. 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4∼5개 목표 추출 및 가중치 부여 ... 99
• 제5장. 연구개발성과의 활용계획 ... 100
• 1절. 활용계획 ... 100
• 2절. 기대효과 ... 101
• 제6장. 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 103
• 1절. 개요 ... 103
• 2절. 해외연구현황 ... 103
• 3절. 해외주요기업기술현황 ... 105
• 제7장. 연구개발성과의 보안등급 ... 106
• 제8장. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비현황 ... 107
• 제9장. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 ... 108
• 제10장. 연구개발과제의 대표적 연구 실적 ... 112
• 제11장. 기타 사항 ... 114
• 제12장. 참고 문헌 ... 115
• 끝페이지 ... 116