초록 ▼

□ 핵심기술
작물보호(유도저항성 등)와 살선충 기능을 지닌 대사물질을 고생산하는 균주, 대량배양 생산기술 및 작물 적용기술.

□ 최종목표
프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 친환경 유기농 농자재 3개 이상 개발 (TRL : [시작] 3단계 ～ [종료] 7단계)
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 탄저병 방제용 천연물 살균제 개발
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 살선충제 개발
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 세균병 및 곰팡이병 방제용 천연물 살균제 개발

□ 핵심기술
작물보호(유도저항성 등)와 살선충 기능을 지닌 대사물질을 고생산하는 균주, 대량배양 생산기술 및 작물 적용기술.

□ 최종목표
프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 친환경 유기농 농자재 3개 이상 개발 (TRL : [시작] 3단계 ～ [종료] 7단계)
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 탄저병 방제용 천연물 살균제 개발
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 천연물 살선충제 개발
- 프로바이오틱 농업미생물 대사체 기반 세균병 및 곰팡이병 방제용 천연물 살균제 개발

□ 개발내용 및 결과
1. Streptomyces sp. AG-P 균주가 생산하는 paromomycin을 이용한 작물보호제 개발
1) 활성물질 생산성 증진을 위한 균주선발 및 개량
- NTG 처리, UV 및 γ-ray 조사방법을 이용하여 paromomycin 생산성이 모균주대비 60배 증가한 고생산 변이주 M19-1 선발
2) 활성물질 고생산 균주의 생산성 및 안정성 분석/평가
- 균주안정화 및 자가내성증강실험을 통해 paromomycin 생산의 안정성 및 재현성 확인및 0.7g/L 생산성 확보
3) 활성물질 생산 극대화를 위한 배지최적화 기술개발
- 탄소원 및 질소원 최적화로서 경제성을 고려하여 Glucose, Corn starch, Soybean meal 선정
- C/N ratio 분석결과 Glucose는 5%, Corn starch는 2.5%, Soybean meal 3.5%를 최적 C/N조건으로 선정
- 파로모마이신 생산성 증진 미량원소로 MnSO₄, MnCl₂, Glutamic acid, Glutamine 선정
- 파로모마이신 생산 최적배지로 경제성을 고려하여 Glucose 5%, Corn starch 2.5%, Soybean meal 3.5%, MnSO₄ 10mM, Glutamine 30mM 선정
4) 활성물질 대량생산을 위한 배양 기술 개발
- 5 L, 50 L, 300L, 500L 발효조 배양조건 수립 및 1.0 g/L 생산성 확보
5) 산업규모 수준 활성물질 분리정제 기술 개발
- 원료단가가 기존 resin에 비해1/150 정도 저렴한 DIAIONWK601 resin을 사용한 분리정제기술 개발
- 독성시험을 위한 원제 제작 및 주관기관에 제공
- 현장 적용시험을 위한 원제제작 및 제공
6) 활성물질 생합성 경로 연구 및 유전체 분석
- paromomycin 생산 균주 Streptomyces sp. AG-P1441 균주의 genome 분석 : genome size 9.63Mb, GC 함량 71.8%
7) 활성물질에 대한 고추 무름병, 역병, 탄저병, 배추 무름병,포도 흰얼룩병, 호박 흰가루병, 인삼 탄저병, 잿빛 곰팡이병 등에 효과를 확인하였다.
8) “흙이랑뿌리랑플러스” 제품 출시
- 활성물질을 이용한 살균제제 개발 및 제형 완료
- 식물병 발생 농가 및 자체 농장에 대한 Filed test 및 방제 프로그램 적용 개발
- 개발제품의 목록공시 등록을 위한 공인기관 시험 완료
- 개발제품의 목록공시 등록 완료

2. Paenibacillus polymyxa 균주가 생산하는 fusaricidin을 이용한 작물보호제 개발
1) 푸자리시딘 고생산 패니바실러스 균주(P. polymyxa EFP10)제작 완료
- 푸자리시딘 생합성 유전자를 제외한 5종의 불필요한 항생물질 유전자 불활성화를 통해 생산을 차단하여 푸자리시딘 생산효율을 15% 이상 제고
- 균주 제작과정에 불가피하게 사용된 항생제 내성 유전자를 모두 제거하여 안전성을 제고
- 개발균주의 유전체 염기서열 해독 및 모균과의 비교분석을 통해 외래 DNA의 잔존이 없음을 확인
- 균주 제작과정에서 포자형성능을 상실하여 자연환경에서의 생존력이 매우 약해짐에 따라 균주의 안전성이 제고
2) 개발균주(P. polymyxa EFP10)를 이용하여 푸자리시딘 대량생산 기술 개발
- 산업규모 대량배양용 배지 조성
- 500 L 배양기를 이용한 배양시험을 반복 수행하여 배양조건을 수립
- 목표치를 상회하는 2.0 g/L 생산성 확보
3) 5 ton 규모 발효조를 이용한 생산시험 완료
- 5000 L 배양기를 이용한 배양시험(working volume = 1500L)을 수행하여 성공적으로 완료
4) 여러 환경조건 하에서의 시험을 통해 푸자리시딘 배양액 및 정제된 푸자리시딘의 장기 보존 시 안정성 확보
- 25~60℃, 60일 보존 시 안정성 확인
- 42 ℃, 150일 보존 시 안정성 확인
- 80~100℃ 열처리 조건에서 안정함을 확인
5) 시제품 내에 함유된 Fusaricidin 함량분석 방법 수립
- 시제품으로부터 분석시료를 제조하는 방법을 수립함
- LC/MS 분석에 의한 정량법을 수립
6) 활성물질에 대한 고추 무름병, 역병, 탄저병, 배추 무름병, 포도 흰얼룩병, 호박 흰가루병, 인삼 탄저병, 잿빛 곰팡이병 등에 효과를 확인하였다.
7) “균잡아” 제품 출시
- 활성물질을 이용한 살균제제 개발 및 제형 완료
- 식물병 발생 농가 및 자체 농장에 대한 Filed test 및 방제 프로그램 적용 개발
- 개발제품의 목록공시 등록을 위한 공인기관 시험 완료
- 개발제품의 목록공시 등록 완료

3. 살선충물질
- 전국 각지에서 채집한 곤충병원성선충으로부터 공생세균을 분리하고, 이를 이용하여 뿌리혹선충 및 기타 식물기생선충에 대한 살선충활성을 검증하여 SCG, GD, SFF등 3개의 공생세균 후보군을 선발하였고, 선발된 공생세균의 배지조건 확립, jar fermenter를 이용한 대량배양조건 확립등 균주 생육조건 최적화를 함.
- 경북 성주군 참외농가에서 채집한 뿌리혹선충을 실험실에서 토마토를 기주식물로하여 누대사육에 성공함으로써, 지속적인 살선충 실험이 가능한 조건을 확립 함
- 최적 배양 조건에서 배양된 공생세균의 배양액을 여러 조건으로 추출하여 살선충 활성을 검정하여본 결과 Cell추출물과 Broth 추출물 모두 살선충 활성이 있는 것을 확인하였으며,특히 Broth 추출물 중 에틸아세테이트 추출물이 활성이 가장 후수한 것으로 나타났으며, pH 조건에서는 매우 안전한 물질인 것으로 판단 됨.
- 추출물을 최종적으로 녹일 때 사용되는 MeOH와 DMSO는 선충에 영향이 없는 것으로 나타났음
- 배양액의 생리활성 검증 결과 항산화효과, 세포보호효과, 항암효과에서 모두 우수한 효과를 나타내어 살선충 외 다른 영역으로의 확대 적용 가능성을 확인 함.
- 전국 각지에서 채집한 곤충병원성선충으로부터 공생세균을 분리하고, 이를 이용하여 뿌리혹선충 및 기타 식물기생선충에 대한 살선충활성을 검증하여 SCG, GD, SFF 등 3개의 공생세균후보군을 선발하였고, 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석을 통한 동정 완료함
- 뿌리혹선충 종별 특성 비교 조사 함.
- 균배양액을 centrifugation (10,000 rpm, 10 min)하여 broth 층과 mycelium cake 층으로 분리하였고, broth 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획 하여 얻어진 추출물을 bioassay하여 항선충 활성이 있는 분획을 확인함.
- 그 결과 Ethyl acetate 층(4.72 g)에서 활성을 보였으며 이 sample을 silica-gel TLC를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였으며, silica gel column chromatography를 이용하여 step-wise gradient로 분리함.
- 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl3 : MeOH = 10:1의 fraction으로 high performance liquid chromatography (HPLC) 단계를 거쳐 활성물질을 분리, 정제함, 이를 Eco-1으로 명명함.
- Eco-1의 화학구조를 결정하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-1의 화학구조를 동정함
- 공생균배양액을 centrifugation (8,000 rpm, 15 min)하여 broth 층과 mycelium cake 층으로 분리하였고, mycelium cake 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 bioassay하여 항선충 활성이 있는 분획을 확인함.
- 그 결과 Hexane 층에서 활성을 보였으며 이 sample을 silica-gel TLC를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였으며, silica gel column chromatography를 이용하여 step-wise gradient로 분리하였음.
- 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl3 : MeOH = 5:1의 fraction으로 high performance liquid chromatography(HPLC) 단계를 거쳐 활성물질을 분리, 정제 함, 이를 Eco-2으로 명명
- Eco-2의 화학구조를 결정하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC,HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-1의 화학구조를 동정한 결과 Anthraquinone 류의 물질로 동정 됨
- 곤충병원성선충 유래 신규 공생박테리아(Xenorhabdus nematophila)로부터 살선충 활성 확인 및 분리 정제
- 공생균배양액을 centrifugation (8,000 rpm, 15 min)하여 broth 층과 mycelium cake 층으로 분리하였고, broth 층을 극 성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획 하여 얻어진 추출물을 bioassay하여 항선충 활성이 있는 분획을 확인함.
- 그 결과 Water 층에서 활성을 보였으며 이 sample을 silica-gel TLC를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였으며, silica gel column chromatography를 이용하여 step-wise gradient로 분리하였음.
- 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl3 : MeOH =5:1의 fraction으로 high performance liquid chromatography(HPLC) 단계를 거쳐 활성물질을 분리, 정제 함, 이를 Eco-3으로 명명
- Eco-2의 화학구조를 결정하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC,HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-3의 화학구조를 동정
- 공생균을 이용한 뿌리혹선충 제제의 제형화를 위한 부자재 탐색진행 결과 천연물 A를 선발할 수 있었으며, 천연물 A는 약효 안정성 및 약해 안전성 등을 평가하여 최적 부자재로 선발할 수 있었음.
- 공생균과 천연물 A의 조함을 이용하여 공생균 배양액 단독처리보다 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 공생균과 천연물 A의 최적 조합비를 완성 함
- 공생균과 천연물 A의 최적 조합비를 이용하여 처리방법 및 시 제품을 개발 완료 함
- 살선충 물질 및 배양체를 이용한 뿌리혹선충 방제제 개발 및 제형 완료
- 뿌리혹선충 발생 농가에 대한 Filed test 및 방제 프로그램 적용 개발
- 개발제품의 목록공시 등록을 위한 공인기관 시험 완료
- 개발제품의 목록공시 등록 완료
- 뿌리혹선충 및 식물기생선충 방제용 유기농업자재 “참선충골드” 출시

□ 기술개발 배경
○ 식량의 안정적 확보는 국가안보 차원에서 중요한 과제이며 안전농산물의 지속 가능한 생산을 뒷받침 할 수 있는 환경 친화적인 농약, 비료 등 농소재의 개발 중요성이 크게 증가되고 있음.
- 본 연구과제에서는 작물 재배에 커다란 장애요인인 식물병(세균병과 탄저병 등 곰팡이병)과 선충을 안전하고 효율적으로 방제할 수 있는 기술과 제품을 개발하고자 함.
- 지난 20여 년간 화학합성 농약을 대체 또는 보완할 수 있는 방법으로서 기능성 미생물을 이용하여 식물의 병ㆍ충을 방제하는 방법이 다수 개발되어 일부는 상용화에 진입하였지만 현장에서의 적용 효율이 화학농약에 비해 낮거나 재현성이 떨어지는 등의 단점이 많아 활용도 제고에 장애가 되고 있음.
- 이를 극복하기 위해 기능성 미생물을 직접 이용하는 방법에서 나아가 농업미생물 유래 기능성 물질, 즉 천연물을 발굴, 제품화 하여 포장에서의 적용효율을 높이고자 함.
○ 천연물을 이용한 작물보호제의 개발에는 수십억 원의 개발비와 5년 이상의 기간이 소요되는데 중소기업이 이를 감당하기에는 어려움이 많아 미생물의 직접 사용 수준을 벗어나지 못하는바 이 벽을 넘어서는 기술을 개발 할 수 있도록 정부의 지원이 필요함.
- 대한민국은 전통적으로 미생물 대사산물 발효생산 기술이 뛰어나고 근래 미생물 생명공학 기술의 발전으로 경쟁력을 지니고 있으므로 농업용으로 적합한 대사체를 선발하여 제품화할 경우 국제적 경쟁력을 가진 제품을 만들어 국내 농업 발전과 수출확대에 기여 하게 될 것임.
- 특히 미생물 대사체를 직접적인 병원균 대응 활성물질로 사용하지 않고 식물체의 저항성을 유도하여 식물병을 방제케하는 물질의 경우에는 합성농약에 비하여 등록절차가 간단한 생화학 농약으로 등록이 가능하여 유리함.
○ 유도저항성을 기반으로 상품화된 미생물 유래 제품은 미국 Bayer에서 개발한 Yield Shield외에 두각을 나타내는 것이 없고 향후 기술개발 경쟁이 치열할 것이 예상되나 본 연구팀이 그동안 확보한 농업미생물 유래 기능성 대사물질과 식물보호관련 기술을 충분히 확보하고 있어 경쟁에서의 승산이 큼. 또한 최근 온난화와 집중강우 등 환경변화에 따른 작물의 환경스트레스가 증가하고 있고 이에 따른 식물 병의 발생도 점차 증가하고 있어 고활성이면서 농작물에 면역기능을 향상시켜 작물보호비용을 감소시키며 친환경 농업에도 기여할 것임.
○ 뿌리혹선충이 뿌리에 침입한 2령 유충은 이동 분산하여 정착한 후 유충은 특수한 생리활성물질을 방출하여 거대세포(다핵세포)를 형성하게 됨. 거대세포 쪽으로 양분이 집중적으로 이동하게 되며 그 결과 식물자체는 영양실조에 이르게되고 혹이 형성된 뿌리는 양분과 수분의 흡수기능이 저하됨. 이러한 지하부의 피해가 클수록 지상부의 생물이 빈약해지며 절간이 짧아지게 되고 엽색이 변하며 심할 경우 작물이 고사하여 농가에 매우 심각한 피해를 끼치고 있음.
○ 우리나라에서는 땅콩, 들깨, 딸기, 토마토, 작약 등의 채소작물, 약용식물, 기타 중요 경제 작물들이 많은 피해를 받고 있음. 시설하우스에서 고소득 채소작물과 화훼식물들이 재배되고 있는데, 이들 또한 당근 뿌리혹선충에 의하여 심한 피해를 받고 있지만 적절한 방제법이 없는 실정임. 뿐만 아니라 살선충제는 독성이 높고, 토양 중 잔류기간이 길며 토양미생물에 광범위한 치사효과를 가진 화합물로서 연용할 경우 지하수를 오염시키거나 환경과 유용한 생물을 위협할 수 있음. 시설하우스와 같은 제한된 공간내 어세의 살선충제를 비롯한 살충-살균제의 다량시용은 농업환경과 농민들의 건강을 위해서도 바람직하지 않음. 따라서 환경에 안전하면서도 경제적이고 효과적인 새로운 뿌리혹선충 방제법 개발이 시급히 요구되고 있는 실정임. 뿐만아니라, 매년 전세계 농업분야에서 식물기생선충에 의한 피해가 800억유로이며, 이에 대한 적극적인 방제를 할 수 있는 친환경적인 방제방법의 보급이 절실히 필요한 실정임. (VIB the Flanders Institute for Biotechnology, 2009).
○ 국내 친환경 농가의 재배면적이 연 80% 이상의 고도성장을 지속하고 있고 친환경 농산물에 대한 소비자 인식이 많이 변하고 있지만, 토양을 통한 식물기생선충의 경우 화학농약기반의 방제수단만이 존재하고 있고, 친환방제수단은 현재 미비한 수준임. 그러므로 친환경제제를 이용한 살선충방제제 개발이 시급한 실정임.
○ 뿌리혹선충이 뿌리에 침입한 2령 유충은 이동 분산하여 정착한 후 유충은 특수한 생리활성물질을 방출하여 거대세포(다핵세포)를 형성하게 됨. 거대세포 쪽으로 양분이 집중적으로 이동하게 되며 그 결과 식물자체는 영양실조에 이르게되고 혹이 형성된 뿌리는 양분과 수분의 흡수기능이 저하됨. 이러한 지하부의 피해가 클수록 지상부의 생물이 빈약해지며 절간이 짧아지게 되고 엽색이 변하며 심할 경우 작물이 고사하여 농가에 매우 심각한 피해를 끼치고 있음.
○ 우리나라에서는 땅콩, 들깨, 딸기, 토마토, 작약 등의 채소작물, 약용식물, 기타 중요 경제 작물들이 많은 피해를 받고 있음. 시설하우스에서 고소득 채소작물과 화훼식물들이 재배되고 있는데, 이들 또한 당근 뿌리혹선충에 의하여 심한 피해를 받고 있지만 적절한 방제법이 없는 실정임. 뿐만 아니라 살선충제는 독성이 높고, 토양 중 잔류기간이 길며 토양미생물에 광범위한 치사효과를 가진 화합물로서 연용할 경우 지하수를 오염시키거나 환경과 유용한 생물을 위협할 수 있음. 시설하우스와 같은 제한된 공간내 어세의 살선충제를 비롯한 살충-살균제의 다량시용은 농업환경과 농민들의 건강을 위해서도 바람직하지 않음. 따라서 환경에 안전하면서도 경제적이고 효과적인 새로운 뿌리혹선충 방제법 개발이 시급히 요구되고 있는 실정임. 뿐만아니라, 매년 전세계 농업분야에서 식물기생선충에 의한 피해가 800억유로이며, 이에 대한 적극적인 방제를 할 수 있는 친환경적인 방제방법의 보급이 절실히 필요한 실정임. (VIB the Flanders Institute for Biotechnology, 2009).
○ 국내 친환경 농가의 재배면적이 연 80% 이상의 고도성장을 지속하고 있고 친환경 농산물에 대한 소비자 인식이 많이변하고 있지만, 토양을 통한 식물기생선충의 경우 화학농약기반의 방제수단만이 존재하고 있고, 친환방제수단은 현재 미비한 수준임. 그러므로 친환경제제를 이용한 살선충방제제 개발이 시급한 실정임.

□ 핵심개발 기술의 의의
○ Streptomyces sp. AG-P 균 유래 paromomycin을 이용한 작물보호제 개발 :
- 균주개량, 배지최적화, 대량생산을 통해 Paromomycin이 1g/L이상 안정적으로 생산되는 기술은 현재까지 보고된 바 없는획기적인 성과임
- Paromomycin 산업적 생산을 위한 대량배양 및 분리정제 기술도 현재까지 보고된 바 없으며 생산비절감으로 실용화에 기여할 것으로 기대됨
○ P. polymyxa 균 유래 fusaricidin을 이용한 작물보호제 개발 :
- Fusaricidin 생산 균주 개발은 고생산성과 안전성을 확보하기 위해 고난이도 게놈엔지니어링 기술과 전통 변이유도 기술을 복합적으로 이용하여 이루어졌으며 세계적으로 앞선 성과임.
- Fusaricidin 산업적 생산을 위한 대량배양 및 분리정제 기술도 보고된 바 없는 세계적으로 앞선 기술임.
○ 살선충제제 개발
- 곤충병원성선충 유래 공생박테리아를 주 원료로 한 뿌리혹선충 및 식물기생선충 방제와 관련된 연구 및 제품 개발은 전 세계에서 ㈜에코윈이 가장 먼저 시도하였으며, 제품화함
- 기존 기술의 경우 미생물의 TOXINE 및 곤충병원성선충에 연구가 치중이 되어 있으므로, 본 개발 기술은 공생박테리아를 안정적으로 대량배양하고 이를 통해 생산되는 대사산물을 통한 식물기생선충 방제 및 제품화함에 있어 새롭게 시도 되는 연구임.
- 본 개발 기술에 이용된 공생박테리아는 국내 토착 곤충병원성 선충의 공생박테리아로 국외의 공생박테리아와는 차이가난다. 따라서 국내 공생박테리아의 ENDOTOXINE 단백질 중 살선충활성을 나타내는 단백질 및 그에 따른 효소, 대사물질의 최적으로 생산하는 균주 및 배양공정 등에서 차이가 있음
- 국내 및 국외 시장에서는 화학농약 혹은 Bt나 제품 등에 치중되어 생산 판매가 이루어 지고 있으나, 현재 쇠퇴기에 접어들었으며, 본 개발 기술을 통한 새로운 토착 곤충병원성선충의 공생박테리아 및 대사산물을 이용한 식물기생선충의 방제 메카니즘을 제시함
- 기존 화학 살선충제의 단점인 주변 환경오염에 대한 문제를 해결 할 수 있는 돌파구를 만들 수 있으며, 실질적인 방제효과가 화학농약 이상의 방제효과를 얻을 수 있어 환경오염으로부터 자유로워 질 수 있음
- 본 연구 이전에는 단순 공생균 배양물을 이용하여 뿌리혹선충을 방제하였지만, 본 연구로 인하여 공생균의 대사산물을 이용한 제품으로 업그레이드 함
- 본 기술은 ㈜에코윈에서 세계 최초로 연구가 진행이 되었음
- 현재 터기, 케냐 등으로 수출이 이루어 지고 있음

□ 적용 분야
천연물 작물보호제 :
- 천연물 살균제
- 천연물 작물 저항성 유도제
- 천연물 살충제
- 뿌리혹선충 및 식물기생선충 방제 분야
- 소나무 재선충 병 치료 및 예방 분야 등

( 출처 : 최종보고서초록 - 3. 개발결과 요약 4p )