[보고서]Syndecan을 활용한 receptor tyrosine kinase 막도메인 매개 선택적 신호전달 기전 연구

오억수

[국가R&D연구보고서] Syndecan을 활용한 receptor tyrosine kinase 막도메인 매개 선택적 신호전달 기전 연구
Studies for the unique role of transmembrane domain of receptor tyrosine kinase on signal transduction based on a mechanistic model of syndecan dimerization 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	이화여자대학교 Ewha Womans University
연구책임자	오억수
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2019-03
과제시작연도	2018
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201900020195
과제고유번호	1711068964
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2020-04-18
키워드	수용체.막도메인.신호전달.이량화.Receptor tyrosine kinase.

초록 ▼

□ 연구개요
Receptor tyrosine kinase (RTK) 막도메인의 dimerization (이량화) 차이가 (i) 세포질도 메인의 이량화 및 구조 변화에 미치는 영향을 조사하고, (ii) RTK 세포질도메인의 선택적 타이로신 인산화 및 SH2 도메인 신호전달 단백질의 선택적 결합기전을 규명함으로서, (iii) 세포신호전달 분야의 미해결 과제인 RTK 세포질도메인의 선택적 조절 방법으로, ‘세포막도메인 특이적 신호전달 조절 기전’을 새롭게 제시하고자 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
수용체 막도메인에 의한 신호전달 기전을 조사하고 막도메인에 의한 수용체 세포질도 메인의 조절기전을 조사하기 위해 막도메인을 통한 dimer 형성 조절이 가능한 syndecan (SDC) 막도메인에 의한 선택적 신호전달 기전을 조사하였음. SDC-2의 경우에는 막도메인 dimer 형성 정도에 따라 대장암 활성 조절 및 MMP-7의 발현을 조절하였으며, SDC-3는 독특하게 oligomer 형성이 증가하는 특징을 가지고 있었음. SDC-3의 oligomer 형성은 신경세포의 세포외기질과의 결합과 이를 통한 dendrite에 형성에 필수적이었음. 또한 SDC 막도메인의 dimer 형성 억제 돌연변이는 초파리의 growth cone 형성과 예쁜꼬마선충의 HSN neuron 발생 및 이동 과정을 저해하였음. 따라서 막도메인의 dimer 형성 또는 결합력은 수용체의 선택적 신호전달을 조절하는 조절인자임.
막도메인에 의한 수용체 세포질도메인 조절 기전을 조사하기 위해 SDC-PDGFR 세포 질도메인이 결합된 키메라를 제작하였음. 이러한 키메라는 SDC 막도메인에 결합력의 차이에 따라 dimer 형성의 차이를 보였음. 키메라 세포질도메인의 기능을 보기 위해서 SDC-PDGFR 세포질도메인 키메라를 HEK293T에 과발현시킨 경우, SDC 막도메인을 가지고 있는 키메라는 PDGFR 세포질도메인의 인산화를 증가시켰고, 하위신호인 MAP Kinase의 활성화를 유도하였으며, 동시에 세포의 증식능을 증가시켰음. 반면 SDC 막도메인 돌연변이 키메라의 경우에는 이러한 효과를 관찰할 수 없었음. 따라서 수용체 막도메인의 결합력 변화는 수용체 세포질도메인의 기능을 조절함을 알 수 있음.
막도메인에 의한 세포질도메인 조절 기전의 선택적을 조사하기 위해 PDGFR의 세포 질도메인에 존재하는 Tyrosine (Tyr) 잔기들의 인산화를 비교하였음. 정상적인 SDC-2 막도메인을 가지고 있는 경우 키메라의 경우 Tyr579과 Tyr857의 인산화가 선택적으로 증가시킨 반면 Tyr716의 인산화는 증가되지 않았음. 이와 일치하게 Tyr579과 Tyr857에 의해서 활성이 증가되는 Src과 PI3K의 인산화 또한 증가되어 막도메인의 이량화 또는 결합의 차이가 수용체 세포질도메인의 활성화를 선택적으로 조절함을 알 수 있음. 추가적으로 막도메인에 의한 세포질도메인의 구조변화를 조사하기 위해 키메라 단백질을 정제하고 결정 형성을 시도하였으나 막도메인을 가지고 있는 키메라의 결정을 얻을 수는 없었음. 키메라 단백질의 막도메인의 dimer 형성정도에 따른 선택적인 인산화 변화와 기능 변화를 미루어 볼 때 수용체 막도메인은 신호전달 조절인자로서 역할을 수행하며, 동시에 세포질도메인의 기능을 선택적으로 조절하는 조절인자라고 생각됨.

□ 연구개발결과의 중요성
✔ 선택적 신호전달 인자로서의 세포막도메인의 선택적 신호전달 기능 확인
✔ RTK 신호전달의 미해결 과제인 RTK의 선택적인 인산화 조절 기전 제시
✔ RTK 막도메인 특이적 신호전달 조절 기전 규명
✔ 질환치료의 새로운 타겟으로 막도메인을 제시

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
(1) 연구 목표 ... 4
(2) 연구 가설 ... 4
(3) 연차별 연구개발의 목표 및 내용 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
(1) Syndecan 막도메인 이량화 기전 및 기능 관련성 규명 ... 5
(2) SDC 막도메인에 시스템 생물학적 기능 조절 기능 조사 ... 9
(3) RTK 막도메인에 의한 세포질 도메인 기능 조절 기전 규명 ... 10
(4) SDC-PDGFR 키메라를 활용한 PDGFR 세포질 도메인 구조 분석 ... 14
3. 연구개발결과의 중요성 ... 15
4. 참고문헌 ... 16
5. 연구성과 ... 18
대표적 연구실적 ... 20
끝페이지 ... 29

표/그림 (17)

표 막도메인 치환 돌연변이체의 막도메인 특이적 dimer 형성능력 (A) SDC-2 와 –4의 막도메인을 치환한 재조합 단백질을 제작. GST-fusion된 각각의 재조합 단백질을 정제, SDS-resistant homo-dimer 비율을 coomassie staining으로 관찰함. (B) western blotting을 이용하여 SDS-resistant homo-dimer 비율을 확인함. *, monomer; **, dimer; W, wild type; GL, glycine to leucine; FI, phenylalanine to isoleucine; IF, isoleucine to phenylalanine
표 막도메인에 의한 SDC-3 다량체 형성 (A) His-fusion된 SDC 단백질을 정제하고, SDS-PAGE gel을 이용하여 분리한 후 coomassie staining (CB)과 His 항체를 이용한 western blotting(WB)을 수행함. (B) 각 SDC family의 짧은 세포외기질도메인 4개 amino acid 를 포함하는 his-fusion 재조합 단백질을 제작 후 정제 하여 CB 와 WB을 이용하여 확인함. (C) His-fusion된 SDC-3재조합 단백질을 정제한 후 질량 분석을 통하여 선택한 band를 분석함. O, oligomer(다량체); D, dimer (이량체); M, monomer(단량체)
표 SDC-3 막도메인 특이적 SDSresistant oligomer 형성 능력 (A) SDC-3와 세포내기질도메인(3C)이 없는 돌연변이 단백질을 정제하고 SDS-resistant한 다량화 형성 능력을 CB와 WB으로 관찰하고 수치화함. (B) SDC-2/-4 의 막도메인을 SDC-3 막도메인(3T)으로 치환한 재조합 단백질을 제작하여 CB와 WB으로 다량화 생성을 확인하고 수치화함. (C) SDC-3 막도메인을 SDC-2 막도메인으로 치환한 His-fusion 단백질을 제작하여 정제한 후 CB와 WB으로 관찰. SDC-3의 막도메인을 SDC-2 막도메인 치환 돌연 변이 경우 다량화 형성이 확인 및 그 변화를 수 치화함
표 397번째 Ala에 의한 SDC-3 막도메인 oligomer 형성 조절. (A) SDC-2/-3의 아미노산 치환 돌연변이의 다량화 정도를 나타냄. (B) SDC-2/-3의 짧은 세포외기질도메인 4개 amino acid를 포함하는 his-fusion 재조합 단백질을 정제하여 SDS-resistant homo-이량화, 다량화의 변화를 CB staining과 WB으로 관찰함. (C) 세포외기질이 짧은 SDC-3 wild type과 막도메인 치환 돌연변이 A397F 재조합 단백질을 size exclusion gel chromatography를 이용하여 사이즈로 분리하여 각 단백질의 농도를 UV 흡광도로 측정함
표 SDC-3 막도메인에 의한 heter-oligomer 형성 조절 SDC-2/-4 wild type과 SDC-2/-3의 4개의 짧은 아미노산만 남아있고 막도 메인 아미노산이 치환된 His-fusion 돌연변이 단백질 2eTC, 2eTC(F167A), 3eTC, 3eTC(A397F)를 정제하여 SDS-resistant dimer 변화를 CB staining과 WB으로 관찰하여 수치화함
표 SDC-3 oligomer 형성과 세포 부착 연관성. (A) SDC-3와 SDC-3 돌연변이 S3(A397F)를 SH-5YSY 세포에 과발현하고 PCR로 유전자 발현을 확인함. (B), (C) SDC-3와 SDC-3 돌연변이 S3(A397F)를 SH-5YSY 세포에 과발현 한 후 xCELLigence system assay와 detachment assay를 활용하여 ECM별 세포의 부착능의 차이를 확인함
표 SDC-3 oligomerization이 dendrite 형성에 미치는 영향 SDC-3와 SDC-3 돌연변이 SDC3(AF)를 SH-5YSY 세포에 과발현 하고 세포 형광염색법을 활용하여 MAP-2를 염색하여 한 세포에 생성된 dendrite 개수와 길이변화를 확인함
표 SDC-2 막도메인 dimer 형성이 대장암 세포의 MMP-7 발현에 미치는 영향. SDC-2와 SDC-2 막도메인 치환 유전자를 초기대장암세포인 HT-29 세포에 과발현 하고 PCR을 통하여 MMP-7의 유전자 발현 변화를 관찰, colony forming assay를 하여 SDC-2 의 이량화 정도에 따른 암활성과 관련된 유전자발현 및 대장암세포에 미치는 영향을 확인함
표 SDC 막도메인의 dimer 형성이 초파리의 axon 형성 및 예쁜꼬마선충의 신경 발생에 미치는 영향. (A) SDC를 제거한 초파리에 SDC-2와 SDC-2 막도메인 돌연변이를 발현시킨 후 FasⅡ항체로 axon을 염색하여 면역염색법으로 axon crossing을 확인(왼쪽, 화살표)하고 수치화함(오른쪽). (B) 예쁜꼬마선충에서 SDC을 제거한 후에 원하는 SDC 돌연변이를 과발현 시켜 예쁜꼬마선충의 발생 복원 정도를 확인하는 시스템동물 모델을 구축함(B, 왼쪽). 이 동물모델에 SDC-1, -2,-3, -4 키메라를 과발현시켜 HSN neuron의 이동을 확인(B, 중간). SDC-2의 막 도메인 돌연변이체를 발현시키고 HSN neuron의 이동을 관찰함
표 막도메인 결합차이 유도용 키메라 제작. SDC 막도메인과 PDGFR의 세포질 도메인 키메라를 4 가지 활용 목적에 맞는 vector에 삽입하여 제작함
표 SDC-PDGFR 키메라 단백질의 이량화 비교 (A) SDC-PDGFR 키메라와 돌연변이 2eTPC, 4eTPC 키메라를 대장균에서 발현하고 다른 SDS 농도 조건으로 lysis한 후 PDGFRβ 항체를 이용하여 western blotting을 수행함. (B) 재조합 키메라 단백질을 coomassie blue staining(왼쪽)과 GST항체를 이용한 western blotting(오른쪽)으로 확인함. (C) SDS-resistant homo-dimer 형성 비율을 coomassie blue staining으로 관찰함. (D) HEK293T 세포에 각각의 키메라와 돌연변이체를 과발현시킨 후 Whole cell lysate (WCL), 막단백질, 세포질 단백질들을 추출하여 HA 항체로 western blotting하여 이량화 정도를 확인함. *, monomer; **, dimer; ***, trimer
표 SDC-2 막도메인-PDGFR 키메라 돌연변이가 Tyrosine 인산화와 세포신호전달 및 세포성장에 미치는 영향. SDC-2의 extracellular domain 4개 아미노산 (KRTE)을 포함한 각각의 막도메인의 wild type과 아미노산 치환 돌연변이체에 human PDGFR의 cytoplasmic domain을 결합한 키메라를 제작하였음. (A) HEK293T 세포에 각각의 키메라를 각각 과발현 시킨 후 total tyrosine 인산화 정도를 western blotting으로 분석함. (B) HEK293T 세포에 각각의 키메라돌연변이체를 과발현 시킨 후 cell lysates를 2시간 동 안 HA-conjugated bead를 이용한 면역침강을 실시한 다음 phospho-tyrosine 항체를 이용하여 western blotting을 통해 확인함. (C) A와 동일한 세포 lysate에서 phospho-ERK 항체를 이용하여 western blotting으로 확인함. (D) 각각의 키메라와 키메라돌연변이체를 과발현시킨 세포로 시간(24, 48시간)에 따른 세포 성장 차이를 MTT 기법으로 확인함
표 SDC-PDGFR 키메라 세포질도메인의 인산화 비교. (A) SDC-2, -4 PDGFR 키메라를 HEK293T 세포에 과발현하고 PDGFRβ 세포질 도메인의 tyrosine 잔기 579, 716 및 857의 인산화 정도를 western blotting으로 분석함. (B) 각각의 키메라 돌연변이체를 HEK293T세포에 발현시킨 후 막단백질을 분리하여 PDGFRβ 세포질 도메인의 tyrosine 인산화 정도를 western blotting으로 확인하고(왼쪽), 수치화함(오른쪽). (C) 각각의 키메라를 HEK293T세포에 발현시킨 후 phopho-Src, phospho-PI3K 항체를 이용하여 western blotting으로 확인 *, monomer; **, dimer
표 SDC-PDGFR truncated form 키메라와 돌연변이체들의 이량화의 비교. (A) PDGFR의 세포질 도메인 중 -557부터 -750까지의 서열로 SDC-PDGFR 키메라를 제작하고 막도메인의 돌연변이체를 제작함. (B) 재조합 벡터들을 과발현시킨 대장균을 lysis하여 coomassie blue staining으로 이량화를 확인한 것(왼쪽)과 GST-bead를 이용하여 정제된 단백질의 이량화를 western blotting으로 확인함(오른쪽). (C) SDC-PDGFR truncated form 키메라와 막도메인 돌연변이를 대장균에 과발현시키고 gel filtration후 chromatography를 진행하여 280nm파장에서 검출하였고, 나타난 peak의 양상을 비교하여 이량화의 변화를 확인하였음. (D) 각 키메라와 돌연변이체들을 과발현시킨 대장균으로부터 단백질을 추출하여 native PAGE 수행 후 coomassie blue staining으로 단백질 발현 변화를 비교함. *, monomer; **, dimer; ***, trimer
표 SDC-PDGFR truncated form 키메라와 SDC 막도메인 돌연변이체 이량화 비교. (A) HA가 tagging된 SDC-PDGFR truncated form 키메라를 과발현시킨 HEK293T세포로부터 총 단백질과 막단백질을 분리하고 HA 항체를 이용하여 Western blotting을 수행함. (B) A와 같은 조건에서 phospho-PDGFR Tyr 579 항체와 phospho-tyrosine 항체를 이용하여 Western blotting으로 확인. (C) 키메라rk 발현된 HEK293T 세포 lysates를 면역침 강한 후 phospho-PDGFR Tyr 579 항체, phospho-tyrosine 항체, HA 항체를 이용하여 western blotting을 수행함. *, monomer; **, dimer
표 SDC-PDGFR 키메라 단백질의 결정화 과정 His-tagging을 활용하여 단백질을 정제 한 후 size exclusion gel chromatography를 추가 분리 후 단백질 sequencing을 통해 확인하고 192가지 buffer에 screening하고 x-ray회절 테스트를 수행함
표 PDGFRβ 세포내기질도메인의 homology modeling을 통한 SDC-PDGFR 키메라의 구조 변화 예측. SWISS-MODEL Homology Modelling 프로그램의 template 5k5x.1A 사용하여 아미노산 561 부터 975 까지와 561부터 750까지의 구조를 예측함. 2eTPC, 2eTPC(GL), 4eTPC PDGFR 세포질도메인 561번째부터 750번째 아미노산 truncation 키메라를 대장균에서 발현하고 다른 SDS 농도 조건으로 lysis한 coomassie blue staining으로 이량화를 확인함

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