초록 ▼

본 연구에서는 과거 개발․확립된 세포배양일본뇌염백신 역가시험 대체시험법에 가장 중요한 물질인 단클론항체를 확립하고자 하였다. 개발․확립된 in vitro 역가 시험 방법은 ELISA 방법으로 capture 용 단클론항체와 detection 용 단클론항체가 필수적이다. 단클론항체를 생산하기 위한 하이브리도마 WCB를 제작하였다. 제조용 세포주의 품질 증명을 위한 시험은 ICH Q5A 및 Q5D 을 참고하여 무균시험, 마이코플라스마 부정 시험, 외래성 바이러스 확인시험을 진행하였다. 식품의약품안전평가원에서 보유하고 있는 MCB를 대량

본 연구에서는 과거 개발․확립된 세포배양일본뇌염백신 역가시험 대체시험법에 가장 중요한 물질인 단클론항체를 확립하고자 하였다. 개발․확립된 in vitro 역가 시험 방법은 ELISA 방법으로 capture 용 단클론항체와 detection 용 단클론항체가 필수적이다. 단클론항체를 생산하기 위한 하이브리도마 WCB를 제작하였다. 제조용 세포주의 품질 증명을 위한 시험은 ICH Q5A 및 Q5D 을 참고하여 무균시험, 마이코플라스마 부정 시험, 외래성 바이러스 확인시험을 진행하였다. 식품의약품안전평가원에서 보유하고 있는 MCB를 대량 배양하여 두 종류의 세포주 (5F15, 7D71) 각 300 바이알 이상의 WCB를 오염 없이 제조하였다. 생산한 하이브리도마 세포를 이용하여 단클론항체를 생산하였다. 하이브리도마 세포를 마우스 복막강으로 주사하여 종양 진행, 복수 축적을 유도하였다. 1일 1회 이상 복부팽창, 쇼크 징후 등과 같은 합병증을 모니터링하여 최적의 효율과 동물 윤리 등을 고려하여 복수를 채취하였다. 클론별 복강 내 복수를 Protein A affinity를 이용하여, 복수로부터 고순도의 항체를 정제하였다. 고순도 정제 후 항체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였으며, 항체 밴드 외에 contaminant로 보이는 band를 확인할 수 없었다. 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC) 방법을 이용하여 정제된 항체의 순도를 확인하였다. 5F15 항체를 분석하였을 때 99.4% 순도로 정제된 것을 확인하였고 7D71 클톤은 96.8% 순도를 보였다. Phage display 방법을 이용하여 생산된 단클론항체의 epitope을 확인하였다. 두 종류의 phage 라이브러리를 이용하여 3라운드의 패닝 DNA를 추출하여 sequencing 하였을 때, 두 종류의 phage 라이브러리에서 공통으로 확인된 부분은 5F15 항체에서 85-91aa(RADSSYV), 477-483aa (DRSIALA) 부분이었고, 7D71항체에서 122-128aa(TSKAIGR), c-term 부분인 496-500aa (TNVHA) 이었다.
생산된 항체의 중화 항체가를 확인한 결과, 5F15 항체의 중화항체가 평균은 5.443, 7D71 항체의 경우 3.537로 확인되었고, 이전 결과와 통계적인 유의성을 확인할 수 없었다. 항체의 가속 안정성을 확인하기 위하여 25℃, 37℃, 56℃에서 1일, 3일, 7일, 14일 보관한 항체를 이용하여 중화항체능을 확인하였을 때 14일 보관 항체에서 중화항체능이 감소함을 확인하였다. 실시간 안정성을 확인하기 위하여 4℃, -70℃에 1주, 2주, 3주, 4주 보관한 항체는 기간별로 중화항체능의 차이는 없었다. 이 결과를 근거로 세계 최초로 세포배양일본뇌염 백신(베이징주) in vitro 역가 대체 시험을 위한 항체 국가표준품을 등록하여 활용할 예정이다.

(출처 : 국문 요약문 3p)

Abstract ▼

This study is a task carried out to establish monoclonal antibodies, which are the most important substances in alternative assays for cell-cultured Japanese encephalitis vaccine potency tests that have been developed and established in the past. The established in vitro potency test method is an EL

This study is a task carried out to establish monoclonal antibodies, which are the most important substances in alternative assays for cell-cultured Japanese encephalitis vaccine potency tests that have been developed and established in the past. The established in vitro potency test method is an ELISA method, and monoclonal antibodies for capture and monoclonal antibodies for detection are essential. Hybridoma WCB for the production of monoclonal antibodies was prepared. To verify the quality of the cell line, sterility test, mycoplasma negative test, and adventitious virus confirmation test were performed with reference to ICH Q5A and Q5D. More than 300 vials of each of the two cell lines (5F15, 7D71) were prepared without contamination by mass culturing the MCB possessed by the NIFDS. Monoclonal antibodies were produced using the produced hybridoma cells. Hybridoma cells were injected into the peritoneal cavity of mice to induce tumor progression and ascites accumulation. Using protein A affinity for intraperitoneal ascites for each clone, high-purity antibodies were stagnated from ascites. After high-purity purification, the purity of the antibody was confirmed by SDS-PAGE. In addition to the antibody band, a band that appeared to be a contaminant could not be identified. The purity of the purified antibody was confirmed using the size exclusion chromatography (SEC) method. When the 5F15 antibody was analyzed, it was confirmed that it was purified to a purity of 99.4%, and the 7D71 clone showed a purity of 96.8%. The epitope of the monoclonal antibody produced was confirmed using the phage display method. When three rounds of panning DNA was extracted and sequencing using two types of phage libraries, the common areas identified in the two types of phage libraries were aa85-91 (RADSSYV), aa477-483 (DRSIALA) in the 5F15 antibody, It was aa122-128 (TSKAIGR) and aa496-500 (TNVHA, the c-term part), in the 7D71 antibody. The neutralizing antibody titer of the produced antibody was confirmed. As a result of 3 repetitions, the weighted average of the neutralizing antibody titer of the 5F15 antibody was 5.443 and that of the 7D71 antibody was 3.537, and statistical significance could not be confirmed with the previous results. In order to confirm the accelerated stability of the antibody, when the neutralizing antibody ability was confirmed using the antibody stored for 1, 3, 7, and 14 days at 25°C, 37°C, and 56°C, the neutralizing antibody ability decreased in the 14-day storage antibody. was confirmed. In order to confirm real-time stability, there was no difference in neutralizing antibody ability for each period of antibodies stored at 4°C and -70°C for 1, 2, 3, and 4 weeks. Based on this result, the world's first cell-cultured Japanese encephalitis vaccine will register and utilize the national antibody standard for in vitro potency replacement test.

(source : Summary 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• 연구개발과제 연구결과 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 12
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 13
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 31
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 34
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 35
• 제7장 참고문헌 ... 36
• 제8장 첨부서류 ... 37
• 끝페이지 ... 38