초록 ▼

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
CAF는 단순히 암을 support하는 걸 넘어 종양면역 억제와 암의 metastastasis를 직접 유발하며 항암제 내성의 주요 원인으로 알려져 있음.
CAF가 특히 집중적으로 많이 분포하는 경우 표적항암제는 물론 면역항암제에도 전혀 반응하지 않으며 CAF가 유력한 원인으로 판단됨.
따라서 본 연구는 암미세환경을 제어할 KEY로 암연관섬유아세포를 통제하여 현재까지의 항암제치료의 한계점을 넘어 설 수 있는 돌파구를 제시하고자 함.

○ 전체 내용
암연관섬유아

□ 연구 목표 및 내용
○ 최종 목표
CAF는 단순히 암을 support하는 걸 넘어 종양면역 억제와 암의 metastastasis를 직접 유발하며 항암제 내성의 주요 원인으로 알려져 있음.
CAF가 특히 집중적으로 많이 분포하는 경우 표적항암제는 물론 면역항암제에도 전혀 반응하지 않으며 CAF가 유력한 원인으로 판단됨.
따라서 본 연구는 암미세환경을 제어할 KEY로 암연관섬유아세포를 통제하여 현재까지의 항암제치료의 한계점을 넘어 설 수 있는 돌파구를 제시하고자 함.

○ 전체 내용
암연관섬유아세포는 새로운 항암치료 표적으로 큰 관심을 받고 있으나 CAF의 다양성과 identity 유지등의 난제로 인해 관련 항암제 개발이 어려움. 본 연구자는 이러한 난제를 돌파하기 위해 ChIP-SEQ을 이용하여 CAF subpopulation의 identity를 결정지으며 유지하게끔 하는 핵심적인 유전자들인 슈퍼인핸 유전자(SE)들을 밝혀내고 그들 사이의 Core Regulatory Circuitry을 연구하여 치료 타겟 가능성이 있는 유전자를 타켓으로 하여 그 효과를 검증하고자 함. 그 중 선행연구를 통해 발굴된 골형성에 중요한 Runx2가 흥미롭게도 CAF 특정하위유형의 강력한 master TF후보임을 확인하였으며 Runx2를 중심으로 하는 CRC연구와 함께 CAF를 직접제어하는 방법으로 Runx2를 제어하는 연구를 통해 암치료에 대해 저항성을 가지는 암 미세 환경의 암 연관 섬유아세포와 비정상적인 섬유아세포에 의해 발병하는 질환들에 대한 극복 방안을 제시하고자 함.

○ 1단계
● 연구 목표
CAF 모델확립 및 검증, 대규모 ChIP-SEQ, Single Cell SEQ 수행, 대규모 시퀀싱 분석, in vitro 검증, 임상적의의 검증 : 목표1. 암연관섬유아세포(CAF) 억제 신규표적발굴 구축에 필요한 다수의 환자유래 CAF확보 및 검증. 목표2. CAF에서의 ChIP-SEQ, RNA-SEQ을 이용하여 CAF 억제 표적 후보 유전자들(Runx2를 포함하는) 도출.
목표3. 실제 환자의 Single cell sequencing 수행 및 public database를 활용하여 발굴해낸 유전자들을 Runx2를 중심으로 형성하는 CRC(핵심조절회로) 와 mode of action을 BI(bio-informatics) 연구로 검증.
목표4. CAF 억제 표적 후보 유전자 Runx2의 임상적으로 중요성 검증.
목표5. CAF 억제 표적의 in vitro 효능 검증 시스템 확립

● 연구 내용
임상적인 의미를 초반부터 가지고 연구를 진행 해야하며 해당분야연구에서의 가장 큰 난관인 CAF의 확보가 절대적으로 필요함. CAF는 상당히 이질성이 강하기 떄문에 최대한 많은 수의 CAF확보가 필요함. 최소 5~10종 이상의 CAF이 필요함. 확보된 CAF들은 확실한 암 촉진 능력을 가지는지 in vitro실험으로 검증 후 사용함. 1차적으로 확보 및 암 촉진 능력이 검증된 CAF를 가지고 ChIP-SEQ, RNA-SEQ을 수행하였음. 활성화 상태로 그 기능을 유지하게 하는 cell identity를 유지하는데 필수적인 super enhancer assoicated genes, (슈퍼인핸서 관련 유전자), 도출해낸 Runx2를 비롯하여 슈퍼인핸서 관련 유전자들(SE)의 발현과 핵심조절회로 (CRC)를 담당하는 유전자들의 발현을 single cell SEQ을 수행하고 public single cell sequencing database도 함께 사용하여 검증. 강력한 master TF후보인 Runx2의 발현 확인을 위해 실제 암 환자 조직에서 면역염색을 시행하고 추가적으로 환자 생존률들의 임상적인 상관관계를 확인. CAF에서 Runx2를 결핍 시켜 그 후보 master TF 로서의 억제 효능을 in vitro 시스템으로 검증하였음. 이때 Runx2와 함께 CRC를 형성하는 다른 후보 유전자에 대해서도 추가적인 검증하고있음.

○ 2단계
● 연구 목표
in vivo 1차검증 및 마우스에서 기존의 항암제 한계를 극복할 수 있는지 여부를 위해 Runx2 억제물질과 병행투여하여 in vivo 2차검증.

● 연구 내용
1. human colon CAF 와 human colon cancer cell line을 이용한 면역결핍 마우스 1^st in vivo study
-human colon CAF에서 runx2의 결핍을 유도한 뒤 대장암세포와 함께 NOD/SCID 마우스에 이식하여 CAF에서 runx2의 억제가 암 성장 및 전이를 억제하는 지 확인.
2. mouse colon CAF 와 mouse colon cancer cell을 이용한 wildtype 마우스 2^nd in vivo study
-기존의 항암제의 한계와 CAF에서의 runx2결핍의 효과를 보더 확실하게 검증하려면 면역결핍 마우스가 아닌 wildtype마우스를 사용하여 추가적인 검증을 해야함. 본 연구자는 mouse colon cancer cell과 함께 mouse colon CAF를 함께 구축하고 있으며 이를 사용하여 실제 암 환자와 유사한 환경을 만들어 검증하고 자 함.
3. small molecule를 활용한 in vitro 검증 및 in vivo study
- 원래의 계획은 single guided RNA의 제작 및 검증 한 뒤 FSP1-cre X LSL-CAS9 mice에 CAF 억제표적을 인지하는 sgRNA를 투입하여 섬유아세포에서만 CAF 억제 표적을 선택적으로 deletion한 마우스를 사용하는 것이었음. 하지만 본 실험에 대한 막대한 sgRNA제작, 동물실험비용의 지출이 매우 클것으로 판단되며, 본 연구자가 작년 이직을 함으로써 유전자변형 마우스 사용에 있어서 어려움이 발생할 수 있음. 또한 기존에 상업적으로 구매할 수 있는 Runx2억제물질(CADD522)는 in vitro에서도 매우 고농도(IC50 value :25uM이상)를 사용해야 함.
xenograft모델에서 in vivo teratment가 가능하긴 하지만 보다 더 좋은 inhibitor가 필요하다고 판단됨. 따라서 본 연구자는 새로운 합성물질을 생산해 내어 CADD522 와 함께 4-5차년도에 in vitro에서의 검증 및, in vivo study에 사용할 예정임.

□ 연구성과
1단계(1-3차년도) 연구를 수행하면서 Runx2가 암연관 섬유아세포의 특정 하위유형을 결정짓는 슈퍼인핸서(SE)관련 유전자이면서 강력한 master TF후보물질임을 알아내었음. 정상적인 섬유아세포에서는 발현을 전혀 하지 않지만 악성종양에서 암세포 주변 암연관섬유아세포에서 이상하게도 매우 강하게 발현함을 실제 환자 조직에서도 확인하였음. Runx2는 정상섬유아세포와 비정상적인 활성화를 가지는 암연관섬유아세포의 특정 하위유형의 차이를 만드는 강력한 master TF로서 역할을 하며 본 연구자는 CAF를 직접적으로 제어 하는 방법으로 CAF에서의 Runx2를 억제하여 치료 타겟으로서의 가치를 검증하고자 1-3차년도에 clinical study, bio-informatics study, ChIP-seq, RNA-seq등의 시퀀싱 수행 및 분석, 체계적인 in vitro system을 구축하여 1단계 연구 목표를 초과달성하였음.
또한 섬유아세포 관련 질환인 keloid fibroblast에서도 runx2의 중요한 역할을 밝혀냈으며(ChIP-seq;h3k27ac, runx2항체) 다른 비정상적인 활성화를 가지는 섬유아세포 관련 질환에서도 Runx2를 통한 억제가 필요하다는 것을 밝혀냈음. 이는 CAF뿐 아니라 다른 섬유아세포 관련 질환(keloid, desmoid tumor등)으로 적용이 가능하며 이들 역시 Runx2 억제를 통한 제어가 가능 할 수 있다는 점을 시사함.
1-3차년도 연구를 진행하면서 본 연구자는 해외학회(AACR, 2023)에서 late-breaking Abstract에 선정되어 abstract 및 poster 2편을 발표를 하였으며, 국제유전학회(ICGSK, 2023)에서도 abstract 1편을 발표하였음.
현재 3차년도 까지의 목표달성을 초과하여 4차년도 in vivo 검증을 미리 시작하여 연구가 진행되면 연구 결과들을 종합하여 SCI급 저널에 논문투고를 준비 하고있음.

□ 연구성과의 활용 계획 및 기대효과
●본 연구개발 성과의 활용방안 및 기대효과
[1] 본 연구를 통해 개발된 효능평가 시스템을 활용해 지속적으로 가치 있는 CAF 억제 치료표적을 발굴하는 데 활용됨. [2] 본 연구에선 효능평가 시스템 개발과 고도화를 위해 실제 CAF 억제 표적의 발굴 작업을 같이 진행하게 됨. 이렇게 발굴된 치료 표적을 CAF의 표지자로 활용하여 협동연구를 통해 새로운 CAF 억제 약제를 발굴하는데 활용될 예정임.
●다양한 비정상 fibroblast의 증식에 의해 생기는 다른 질환으로 응용 : 본 연구는 섬유아세포관련 질환의 치료제를 개발하는 데에 큰 공헌을 할 수 있음. 관련 질환에는 Atherosclerosis (죽상경화증), desmoid tumor, Keloid, fibrosarcoma, IPF (idiopathic pulmonary fibrosis) 등으로 다양함. 본 과제의 성과는 CAF 억제 신약을 개발하는 데 직접 활용되며 간접적으로 섬유화를 유발하는 비정상 섬유아세포와도 유사한 면이 많아 난치성 섬유화 질환의 치료제 개발에도 곧바로 활용될 수 있음.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 6
• 1. 연구과제의 개요 ... 7
• 2. 연구과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 8
• 3. 연구과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 9
• 1) 연구수행 결과 ... 9
• 2) 목표 달성 수준 ... 12
• 4. 연구성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 13
• 5. 연구성과의 관리 및 활용 계획 ... 13
• 6. 다음 단계 연구계획 ... 13
• 1) 연구 목표 및 내용 ... 13
• 2) 연구 추진전략 ... 15
• 3) 연구 추진일정 및 기대성과 ... 15
• 4) 다음 단계 연구비 사용계획 ... 16
• 5) 연구 성과의 활용방안 및 기대효과 ... 16
• 끝페이지 ... 24