한글초록 : 차나무에서 딴 잎으로 만들어 뜨거운 물에 우린 차는 예전 신라시대부터 선조들이 즐겨 마셔온 기호음료이다. 최근 녹차 시장의 개방에 따른 차 가격의 인하와 다양한 상품의 도입 등으로 인해 차 시장은 더욱더 확대되었고, 차 소비 역시 증가하고 있는 추세이다. 차의 주요성분으로는 카테킨, 카페인, 아미노산, 비타민 및 무기질 등이 있으며 이들 화학성분들은 여러 가지 생리활성과 약리효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 차에 대한 연구는 거의 잎에 관한 연구이며, 종자는 거의 폐기되기 때문에 종자에 관한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구는 차나무 종자 추출물의 항종양 ...
한글초록 : 차나무에서 딴 잎으로 만들어 뜨거운 물에 우린 차는 예전 신라시대부터 선조들이 즐겨 마셔온 기호음료이다. 최근 녹차 시장의 개방에 따른 차 가격의 인하와 다양한 상품의 도입 등으로 인해 차 시장은 더욱더 확대되었고, 차 소비 역시 증가하고 있는 추세이다. 차의 주요성분으로는 카테킨, 카페인, 아미노산, 비타민 및 무기질 등이 있으며 이들 화학성분들은 여러 가지 생리활성과 약리효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 차에 대한 연구는 거의 잎에 관한 연구이며, 종자는 거의 폐기되기 때문에 종자에 관한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구는 차나무 종자 추출물의 항종양 활성물질을 분리하고자 하였다. 본 연구에서는 30년생의 차나무 (Camellia sinensis L.) 열매를 시료로 사용하였다. 열매는 내피를 포함하여 분쇄한 종자를 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다. 본 연구에서는 종양세포주로 HEC-1B (human uterus carcinoma), SK-OV-3 (human ovary carcinoma), SW-156 (human kidney carcinoma), DLD-1 (human colon carcinoma), Hep-2 (human larynx carcinoma), SK-MES-1 (human lung carcinoma) 을 사용하였고 정상세포주로는 293T (human embryonic kidney) 를 사용하였다. 차나무 종자 추출물의 항종양 활성은 MTT assay를 사용하여 측정하였다. 건조 분쇄한 종자 100 g에 1 L의 증류수를 가하여 실온에서 12시간 동안 3회 반복 추출한 후 원심분리 (3,000 rpm, 4℃, 15 min) 하여 침전물을 제거한 후 상등액을 취해 Diaion HP-20 column에 흡착시킨 후 Diaion HP-20에 흡착된 성분을 용출하기 위해 stepwise 방법으로 0-100% methanol을 사용하여 순차적으로 용출한 후 항암활성을 측정하였다. 항종양 활성분획을 silica gel column chromatography를 이용하여 분리하기 위해 유리 column에 silica gel G60으로 slurry를 조제하여 충진하였고 전개용매는 ethylacetate/methanol/water (100:40:10, v/v) 와 ethylacetate/ methanol/water (90:40:20, v/v) 를 사용하였다. 각각의 분획은 fraction당 1분씩 fraction collector를 이용하여 분취하였고, 254 nm의 파장에서 UV spectrophotometer를 이용하여 peak별로 모아 감압 농축하여 종양세포 증식 억제효과 측정한 후 HPLC를 이용하여 분취 및 정제하였다. Waters μBondapak™ C18 column (10μm, 19 × 300 mm) 을 사용하였고 이동상은 100-20% methanol이 되도록 gradient 방법을 이용한 후 50% methanol을 사용하였다. 차나무 종자 물추출물의 항종양 활성을 측정한 결과 500 μg/mL에서 HEC-1B는 17.43%, Hep-2는 98.41%, SK-MES-1은 98.01%, SK-OV-3는 98.32%, SW-156은 98.21%의 세포증식 억제효과를 나타냈다. Diaion HP-20 column chromatography를 이용하여 분리된 각 분획 (W-1, W-2, W-3, W-4, W-5, W-6) 의 항종양 활성을 측정한 결과 50 μg/mL에서는 18.4% (W-1), 2.7% (W-2), 6.2% (W-3), 53.3% (W-4), 47.1% (W-5), 92.1% (W-6)로 나타났고 100 μg/mL에서는 19.8% (W-1), 5.5% (W-2), 10.4% (W-3), 98.9% (W-4), 98.5% (W-5), 98% (W-6) 로 나타났다. 활성이 가장 높게 측정된 분획을 농축한 후 silica gel column chromatography를 실행한 결과 2개의 분획 (S-1, S-2) 을 얻었다. S-1 (100 μg/mL) 의 경우 SW-156은 4.57%, HEC-1B는 15.38%, DLD-1은 6.48%, Hep-2는 26.51%, SK-MES-1은 27.49%의 세포증식 억제효과가 나타났으며, S-2 (100 μg/mL) 의 경우 SW-156은 8,6%, HEC-1B는 36.9%, DLD-1은 91.2%, Hep-2는 99%, SK-MES-1은 98.5%의 항종양 활성을 나타냈다. S-2를 Gradient 방법을 이용하여 HPLC로 분리한 결과 1개의 분획 (SH) 을 얻은 후 60% methanol을 이동상으로 하여 다시 HPLC 시행하여 SHH-1과 SHH-2를 얻었다. SHH-2의 항종양 활성은 각각의 농도 (25, 50, 100 μg/mL) 에서 Hep-2 에 대하여 20.25, 76.21, 91.67%를 나타냈고 SK-MES-1에 대하여 22.9, 93.1, 98.5%를 나타냈다. 그러나 정상세포주인 293T에서는 24.2, 32.59, 43.21%의 낮은 세포증식억제효과가 나타나 종양세포에만 특이적으로 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 토대로 분리된 차나무 종자 물추출물의 항종양 활성물질이 암 치료제나 암 예방식품의 첨가제로서 가치가 있을 것으로 추측되며 이러한 물질의 구조 분석에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다영문초록 : The tea plant (Camellia sinensis L.) has been cultivated in Asia for thousands of years. The green tea is an evergreen perennial plant, which has been lately recognized for its therapeutic value. The purpose of this study was to determine extract from seed of C. sinensis L. can inhibit tumor growth against several tumor cell lines.To determine the growth inhibitory effect of water extract of green tea seed, five cell lines (HEC-1B, Hep-2, SK-MES-1, SK-OV-3, SW-156) were exposed to increasing concentrations and anticancer activity was determined by MTT assay. As a result, Hep-2 and SK-MES-1 are more sensitive whereas HEC-1B, SK-OV-3, and SW-156 are relatively less sensitive to water extract treatment.At a concentration of 50 μg/mL, the W-1, W-2, W-3, W-4, W-5 and W-6 fractions inhibited cell growth by 18.4, 2.7, 6.2, 53.3, 47.1 and 92.1% against Hep-2 cell line, respectively, and growth inhibition of each fraction at 100 μg/mL increased by 19.8, 5.5, 10.4, 98.9, 98.5 and 98.0% against Hep-2 cell line, respectively. At a concentration of 50 μg/mL, the W-1, W-2, W-3, W-4, W-5 and W-6 fractions inhibited cell growth by 7.7, 10.5, 10.0, 47.8, 43.6 and 95.1% against SW-156 cell line, respectively, and growth inhibition effect of same fractions at 100 μg/mL exhibited 14.4, 18.7, 29.7, 98.36, 98.5 and 98.9% against SW-156 cell line.The active fractions obtained by Diaion HP-20 column chromatography were separated sequentially with silica gel column chromatography using a gradient solvent system. Cell growth of the S-1 were inhibited by less than 30% with 100 μg/mL against all cell lines, the S-2 inhibited cell growth by 91%, 99%, and 98% against DLD-1, Hep-2, and SK-MES-1 cell lines, respectively.The concentrated S-2 redissolved in methanol was separated by HPLC. The inhibitory effect of the SHH-2 was exhibited 20.25, 76.21 and 91.67% against Hep-2 cell line at the concentration of 25, 50 and 100 μg/mL, respectively, and exhibited 22.9, 93.1 and 98.5% against SK-MES-1 cell line at the same concentration. Though, the SHH-2 inhibited cell growth by 24.2, 32.59 and 43.21% against the human embryonic kidney 293T cell line. Hence, the inhibitory activity against the normal cell line 293T was much lower than for human tumor cell lines
한글초록 : 차나무에서 딴 잎으로 만들어 뜨거운 물에 우린 차는 예전 신라시대부터 선조들이 즐겨 마셔온 기호음료이다. 최근 녹차 시장의 개방에 따른 차 가격의 인하와 다양한 상품의 도입 등으로 인해 차 시장은 더욱더 확대되었고, 차 소비 역시 증가하고 있는 추세이다. 차의 주요성분으로는 카테킨, 카페인, 아미노산, 비타민 및 무기질 등이 있으며 이들 화학성분들은 여러 가지 생리활성과 약리효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 차에 대한 연구는 거의 잎에 관한 연구이며, 종자는 거의 폐기되기 때문에 종자에 관한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구는 차나무 종자 추출물의 항종양 활성물질을 분리하고자 하였다. 본 연구에서는 30년생의 차나무 (Camellia sinensis L.) 열매를 시료로 사용하였다. 열매는 내피를 포함하여 분쇄한 종자를 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다. 본 연구에서는 종양세포주로 HEC-1B (human uterus carcinoma), SK-OV-3 (human ovary carcinoma), SW-156 (human kidney carcinoma), DLD-1 (human colon carcinoma), Hep-2 (human larynx carcinoma), SK-MES-1 (human lung carcinoma) 을 사용하였고 정상세포주로는 293T (human embryonic kidney) 를 사용하였다. 차나무 종자 추출물의 항종양 활성은 MTT assay를 사용하여 측정하였다. 건조 분쇄한 종자 100 g에 1 L의 증류수를 가하여 실온에서 12시간 동안 3회 반복 추출한 후 원심분리 (3,000 rpm, 4℃, 15 min) 하여 침전물을 제거한 후 상등액을 취해 Diaion HP-20 column에 흡착시킨 후 Diaion HP-20에 흡착된 성분을 용출하기 위해 stepwise 방법으로 0-100% methanol을 사용하여 순차적으로 용출한 후 항암활성을 측정하였다. 항종양 활성분획을 silica gel column chromatography를 이용하여 분리하기 위해 유리 column에 silica gel G60으로 slurry를 조제하여 충진하였고 전개용매는 ethylacetate/methanol/water (100:40:10, v/v) 와 ethylacetate/ methanol/water (90:40:20, v/v) 를 사용하였다. 각각의 분획은 fraction당 1분씩 fraction collector를 이용하여 분취하였고, 254 nm의 파장에서 UV spectrophotometer를 이용하여 peak별로 모아 감압 농축하여 종양세포 증식 억제효과 측정한 후 HPLC를 이용하여 분취 및 정제하였다. Waters μBondapak™ C18 column (10μm, 19 × 300 mm) 을 사용하였고 이동상은 100-20% methanol이 되도록 gradient 방법을 이용한 후 50% methanol을 사용하였다. 차나무 종자 물추출물의 항종양 활성을 측정한 결과 500 μg/mL에서 HEC-1B는 17.43%, Hep-2는 98.41%, SK-MES-1은 98.01%, SK-OV-3는 98.32%, SW-156은 98.21%의 세포증식 억제효과를 나타냈다. Diaion HP-20 column chromatography를 이용하여 분리된 각 분획 (W-1, W-2, W-3, W-4, W-5, W-6) 의 항종양 활성을 측정한 결과 50 μg/mL에서는 18.4% (W-1), 2.7% (W-2), 6.2% (W-3), 53.3% (W-4), 47.1% (W-5), 92.1% (W-6)로 나타났고 100 μg/mL에서는 19.8% (W-1), 5.5% (W-2), 10.4% (W-3), 98.9% (W-4), 98.5% (W-5), 98% (W-6) 로 나타났다. 활성이 가장 높게 측정된 분획을 농축한 후 silica gel column chromatography를 실행한 결과 2개의 분획 (S-1, S-2) 을 얻었다. S-1 (100 μg/mL) 의 경우 SW-156은 4.57%, HEC-1B는 15.38%, DLD-1은 6.48%, Hep-2는 26.51%, SK-MES-1은 27.49%의 세포증식 억제효과가 나타났으며, S-2 (100 μg/mL) 의 경우 SW-156은 8,6%, HEC-1B는 36.9%, DLD-1은 91.2%, Hep-2는 99%, SK-MES-1은 98.5%의 항종양 활성을 나타냈다. S-2를 Gradient 방법을 이용하여 HPLC로 분리한 결과 1개의 분획 (SH) 을 얻은 후 60% methanol을 이동상으로 하여 다시 HPLC 시행하여 SHH-1과 SHH-2를 얻었다. SHH-2의 항종양 활성은 각각의 농도 (25, 50, 100 μg/mL) 에서 Hep-2 에 대하여 20.25, 76.21, 91.67%를 나타냈고 SK-MES-1에 대하여 22.9, 93.1, 98.5%를 나타냈다. 그러나 정상세포주인 293T에서는 24.2, 32.59, 43.21%의 낮은 세포증식억제효과가 나타나 종양세포에만 특이적으로 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 토대로 분리된 차나무 종자 물추출물의 항종양 활성물질이 암 치료제나 암 예방식품의 첨가제로서 가치가 있을 것으로 추측되며 이러한 물질의 구조 분석에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다영문초록 : The tea plant (Camellia sinensis L.) has been cultivated in Asia for thousands of years. The green tea is an evergreen perennial plant, which has been lately recognized for its therapeutic value. The purpose of this study was to determine extract from seed of C. sinensis L. can inhibit tumor growth against several tumor cell lines.To determine the growth inhibitory effect of water extract of green tea seed, five cell lines (HEC-1B, Hep-2, SK-MES-1, SK-OV-3, SW-156) were exposed to increasing concentrations and anticancer activity was determined by MTT assay. As a result, Hep-2 and SK-MES-1 are more sensitive whereas HEC-1B, SK-OV-3, and SW-156 are relatively less sensitive to water extract treatment.At a concentration of 50 μg/mL, the W-1, W-2, W-3, W-4, W-5 and W-6 fractions inhibited cell growth by 18.4, 2.7, 6.2, 53.3, 47.1 and 92.1% against Hep-2 cell line, respectively, and growth inhibition of each fraction at 100 μg/mL increased by 19.8, 5.5, 10.4, 98.9, 98.5 and 98.0% against Hep-2 cell line, respectively. At a concentration of 50 μg/mL, the W-1, W-2, W-3, W-4, W-5 and W-6 fractions inhibited cell growth by 7.7, 10.5, 10.0, 47.8, 43.6 and 95.1% against SW-156 cell line, respectively, and growth inhibition effect of same fractions at 100 μg/mL exhibited 14.4, 18.7, 29.7, 98.36, 98.5 and 98.9% against SW-156 cell line.The active fractions obtained by Diaion HP-20 column chromatography were separated sequentially with silica gel column chromatography using a gradient solvent system. Cell growth of the S-1 were inhibited by less than 30% with 100 μg/mL against all cell lines, the S-2 inhibited cell growth by 91%, 99%, and 98% against DLD-1, Hep-2, and SK-MES-1 cell lines, respectively.The concentrated S-2 redissolved in methanol was separated by HPLC. The inhibitory effect of the SHH-2 was exhibited 20.25, 76.21 and 91.67% against Hep-2 cell line at the concentration of 25, 50 and 100 μg/mL, respectively, and exhibited 22.9, 93.1 and 98.5% against SK-MES-1 cell line at the same concentration. Though, the SHH-2 inhibited cell growth by 24.2, 32.59 and 43.21% against the human embryonic kidney 293T cell line. Hence, the inhibitory activity against the normal cell line 293T was much lower than for human tumor cell lines
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