DNA 추출방법에 따른 LCDV(Lymphocystis disease virus)의 검출능의 개선 Efficient detection method for LCDV(lymphocystis disease virs) in Olive flounder Paralichthys olivaceus원문보기
넙치의 주요 바이러스성 병원체인 lymphocystis disease virus(LCDV)를 넙치 조직과 세포에서 PCR을 이용하여 검출 효율을 높이고자 PCR 실험 수행 전처리 과정으로서 LCDV의 효율적인 회수방법과 농축조건을 확립함으로서 부적절한 전처리 과정과 PCR inhibitor에 의한 가짜음성판정을 막고 경제적이며 신속한 바이러스 진단방법을 확립하고자 본 실험을 수행하였다. 넙치의 피부 조직과 lymphocystis disease cell에서 효율적으로 LCDV 회수를 위하여 2가지 추출용액(TE ...
넙치의 주요 바이러스성 병원체인 lymphocystis disease virus(LCDV)를 넙치 조직과 세포에서 PCR을 이용하여 검출 효율을 높이고자 PCR 실험 수행 전처리 과정으로서 LCDV의 효율적인 회수방법과 농축조건을 확립함으로서 부적절한 전처리 과정과 PCR inhibitor에 의한 가짜음성판정을 막고 경제적이며 신속한 바이러스 진단방법을 확립하고자 본 실험을 수행하였다. 넙치의 피부 조직과 lymphocystis disease cell에서 효율적으로 LCDV 회수를 위하여 2가지 추출용액(TEbuffer, Tris buffer) 및 2가지 농축용액(polyethylene glycol, zirconium hydroxide)을 사용한 후 phenol-chloroform법 또는 DNA extraction kit법을 사용하여 LCDV 검출 방법을 비교하였다. 피부조직에서 LCDV를 검출하고자 수행된 12가지 방법 중 Tris buffer를 사용하여 균질화 시킨 후 10분간 zirconium hydroxide로 바이러스를 농축한 후 phenol- chloroform법을 사용한 방법이 1×10^(6)까지 희석된 시료에서 양성반응을 보였으나, 다른 실험방법들은 1×10³~10^(6)까지 다양한 검출한계를 보였다. 또한 1시간 이상의 농축과정을 요구하는 다른 검출방법들보다 zirconium hydroxide를 사용 시 실험수행시간이 단축되었고 phenol-chloroform의 사용을 통해 상업용 kit를 대체할 수 있는 경제적인 실험방법을 제시하였다. LCD cell를 사용하였을 시, Tris buffer를 사용 하여 균질화 시킨 후 DNA extraction kit법을 사용한 방법이 1×10^(9)까지 희석된 시료에서 검출되었고, Tris buffer를 사용하여 LCD cell을 균질화하고 PEG로 바이러스 농축 후 phenol-chloroform법과 DNA extraction kit법 그리고 TE buffer를 사용하여 균질화 시킨 후 polyethylene glycol로 바이러스를 농축한 후 DNA extraction kit법을 사용하여 핵산을 추출한 3가지 방법들이 1×10^(7)까지 희석된 시료에서 검출되었다.
결론적으로, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 시 TE buffer를 사용한 실험법들 보다 더 높은 회수율을 확인할 수 있었으며, 신속한 실험수행 측면에서 보면 피부 및 LCD cell을 사용하여 비교하면 Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 바이러스 농축과정 없이 DNA extraction kit법을 사용한 방법이 각각 1×10^(6), 1×10^(9)까지 희석한 시료에서 검출되었다. 그리고 DNA extraction kit를 대체하는 phenol-chloroform법을 사용하여 수행하는 측면에서 보면 피부의 경우, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 zirconium hydroxide으로 바이러스를 농축한 후 phenol-chloroform법으로 핵산을 분리한 방법이 1×10^(6)까지 희석한 시료에서 검출하였으며, LCD cell의 경우, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 polyethylene glycol로 바이러스를 농축한 후 phenol-chloroform법으로 핵산을 분리한 방법이 1×10^(7)까지 희석된 시료에서 검출되었다. 본 연구는 어류에서 다양한 병원성 바이러스를 경제적이면서 효율적으로 회수하고 농축함으로서 검출율 개선에 대한 연구에 응용될 수 있다고 본다.
넙치의 주요 바이러스성 병원체인 lymphocystis disease virus(LCDV)를 넙치 조직과 세포에서 PCR을 이용하여 검출 효율을 높이고자 PCR 실험 수행 전처리 과정으로서 LCDV의 효율적인 회수방법과 농축조건을 확립함으로서 부적절한 전처리 과정과 PCR inhibitor에 의한 가짜음성판정을 막고 경제적이며 신속한 바이러스 진단방법을 확립하고자 본 실험을 수행하였다. 넙치의 피부 조직과 lymphocystis disease cell에서 효율적으로 LCDV 회수를 위하여 2가지 추출용액(TE buffer, Tris buffer) 및 2가지 농축용액(polyethylene glycol, zirconium hydroxide)을 사용한 후 phenol-chloroform법 또는 DNA extraction kit법을 사용하여 LCDV 검출 방법을 비교하였다. 피부조직에서 LCDV를 검출하고자 수행된 12가지 방법 중 Tris buffer를 사용하여 균질화 시킨 후 10분간 zirconium hydroxide로 바이러스를 농축한 후 phenol- chloroform법을 사용한 방법이 1×10^(6)까지 희석된 시료에서 양성반응을 보였으나, 다른 실험방법들은 1×10³~10^(6)까지 다양한 검출한계를 보였다. 또한 1시간 이상의 농축과정을 요구하는 다른 검출방법들보다 zirconium hydroxide를 사용 시 실험수행시간이 단축되었고 phenol-chloroform의 사용을 통해 상업용 kit를 대체할 수 있는 경제적인 실험방법을 제시하였다. LCD cell를 사용하였을 시, Tris buffer를 사용 하여 균질화 시킨 후 DNA extraction kit법을 사용한 방법이 1×10^(9)까지 희석된 시료에서 검출되었고, Tris buffer를 사용하여 LCD cell을 균질화하고 PEG로 바이러스 농축 후 phenol-chloroform법과 DNA extraction kit법 그리고 TE buffer를 사용하여 균질화 시킨 후 polyethylene glycol로 바이러스를 농축한 후 DNA extraction kit법을 사용하여 핵산을 추출한 3가지 방법들이 1×10^(7)까지 희석된 시료에서 검출되었다.
결론적으로, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 시 TE buffer를 사용한 실험법들 보다 더 높은 회수율을 확인할 수 있었으며, 신속한 실험수행 측면에서 보면 피부 및 LCD cell을 사용하여 비교하면 Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 바이러스 농축과정 없이 DNA extraction kit법을 사용한 방법이 각각 1×10^(6), 1×10^(9)까지 희석한 시료에서 검출되었다. 그리고 DNA extraction kit를 대체하는 phenol-chloroform법을 사용하여 수행하는 측면에서 보면 피부의 경우, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 zirconium hydroxide으로 바이러스를 농축한 후 phenol-chloroform법으로 핵산을 분리한 방법이 1×10^(6)까지 희석한 시료에서 검출하였으며, LCD cell의 경우, Tris buffer를 사용하여 시료를 균질화 후 polyethylene glycol로 바이러스를 농축한 후 phenol-chloroform법으로 핵산을 분리한 방법이 1×10^(7)까지 희석된 시료에서 검출되었다. 본 연구는 어류에서 다양한 병원성 바이러스를 경제적이면서 효율적으로 회수하고 농축함으로서 검출율 개선에 대한 연구에 응용될 수 있다고 본다.
Polymerase chain reaction has been proposed as a useful tool for the detection of viral pathogens. However, the PCR-based methods are highly dependent on the methods of virus concentration and nucleic acid purification. Inefficient virus recovery and concentration methods could possibly cause false-...
Polymerase chain reaction has been proposed as a useful tool for the detection of viral pathogens. However, the PCR-based methods are highly dependent on the methods of virus concentration and nucleic acid purification. Inefficient virus recovery and concentration methods could possibly cause false-negative results of PCR assay in samples infected with lymphocystis disease virus (LCDV). Twelve LCDV detection methods were performed to evaluate the detection limit of PCR using elution buffers(TE and Tris buffer), concentration solutions(polyethylene glycol and zirconium hydroxide) and DNA isolation methods(phenol-chloroform and DNA extraction kit). The detection limit of LCDV treated with Tris buffer, zirconium hydroxide and phenol-chloroform was 10^(6) fold dilution, which showed 1000-fold higher sensitivity than the other method using Tris buffer and phenol-chloroform in PCR from skin samples, whereas the detection limit of LCDV treated with Tris buffer and DNA extraction kit was 10^(9) fold dilution, which 10^(6)-fold higher sensitivity than the other method using Tris buffer and phenol-chloroform in PCR from LCD cells. This study suggested that it is a method that is efficient for potential use in the detection of various virus from fish.
Polymerase chain reaction has been proposed as a useful tool for the detection of viral pathogens. However, the PCR-based methods are highly dependent on the methods of virus concentration and nucleic acid purification. Inefficient virus recovery and concentration methods could possibly cause false-negative results of PCR assay in samples infected with lymphocystis disease virus (LCDV). Twelve LCDV detection methods were performed to evaluate the detection limit of PCR using elution buffers(TE and Tris buffer), concentration solutions(polyethylene glycol and zirconium hydroxide) and DNA isolation methods(phenol-chloroform and DNA extraction kit). The detection limit of LCDV treated with Tris buffer, zirconium hydroxide and phenol-chloroform was 10^(6) fold dilution, which showed 1000-fold higher sensitivity than the other method using Tris buffer and phenol-chloroform in PCR from skin samples, whereas the detection limit of LCDV treated with Tris buffer and DNA extraction kit was 10^(9) fold dilution, which 10^(6)-fold higher sensitivity than the other method using Tris buffer and phenol-chloroform in PCR from LCD cells. This study suggested that it is a method that is efficient for potential use in the detection of various virus from fish.
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