[학위논문]최근 콩에 발생하는 바이러스병의 특성과 전사체 분석을 이용한 바이러스의 진단 Recently incidence and characteristic of soybean viruses and diagnosis of pathogens by analysis of RNA transcriptome원문보기
현재 국내에서 사용되고 있는 몇 가지 바이러스 진단방법은 ELISA, RT-PCR, Real time-PCR, DNA-chip 등이 이용되어 왔다. 이들 방법의 경우 특정 바이러스의 확인이 주가 되어 수행되는 방법이었으나, 예상하지 못한 바이러스에 대한 진단과 관리에는 어려움이 있었다. 기존 바이러스 동정기법의 한계를 극복하기 위해 NGS 기반의 집단 ...
현재 국내에서 사용되고 있는 몇 가지 바이러스 진단방법은 ELISA, RT-PCR, Real time-PCR, DNA-chip 등이 이용되어 왔다. 이들 방법의 경우 특정 바이러스의 확인이 주가 되어 수행되는 방법이었으나, 예상하지 못한 바이러스에 대한 진단과 관리에는 어려움이 있었다. 기존 바이러스 동정기법의 한계를 극복하기 위해 NGS 기반의 집단 전사체를 이용하여 바이러스 등 병원체 진단을 통하여, 신, 변종 바이러스를 효율적으로 동정하고자 하는 노력이 최근 다방면에서 이루어지고 있다. 이번연구에서는 대구 하빈에서의 육종포장에서 발생하는 바이러스의 유전체 분석을 위해 약 3000개체의 시료를 1차로, 2012∼2014년 전국적으로 채집된 미확인 채집시료를 2차로하여 이들의 RNA를 pooling하여 분석에 이용하였다. 1차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 1,000bp 이상의 유전정보를 BLAST 한 결과 Bean common mosaic virus 12개, Bean yellow mosaic virus 6개, Soybean mild mottle virus 6개로 70.6%를 차지하였다. 1차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 1,000bp 이하의 유전정보를 BLSAT 한 결과 Bean common mosaic virus 22개, Bean yellow mosaic virus 18개, Faba bean necrotic yellow virus 5개로 86.5%를 차지하였다. 2차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 유전정보를 BLSAT 한 결과 Soybean mosaic virus 23개, Alfalfa mosaic virus 20개, Bean common mosaic virus 19개, Glycine max virus 15개, Peanut stunt virus 11개로 80%를 차지하였다. 지금까지 BCMV, AMV, PSV는 종특이 진단 priemr를 이용하여 RT-PCR 진단을 통해 채집된 시료들을 분석하였다. 하지만, 2012년~2015년까지 채집된 시료에서 AMV는 지금까지 검출되지 않았으며, BCMV와 PSV는 확인은 되나 많은 비율을 차지하지 못하였다. 위의 결과를 보았을 때 이들 바이러스들의 변이종이 많이 존재하는 것으로 추측된다. 1차, 2차 시료들의 분석 정보를 확인한 결과 BBWV, BPMV, BSBV, BYMV, MYMV 등과 같은 국내 미보고 종들이 다수 존재할 것으로 예상된다.국내 콩에서는 SMV, SbDV, AMV, CMV, CPMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV와 BCMV가 보고되었다. 과거 이들 바이러스 중에서 SMV가 심각한 피해를 입히고 있으며, 90%이상 우점하는 것으로 보고되었다. 하지만, 최근 SMV의 발생률은 30% 정도로 낮아졌으며, SYMMV, SYCMV와 PSV 등 신문제 바이러스 병해가 피해를 주고 있는 것으로 확인되었다. 최근 기후 및 재배환경의 변화와 국제 농산물 교역으로 인해 병 발생 양상이 급속하게 변하고 있음을 나타내는 단적인 예인 것이다. 또한, 새로운 매개충과 전염원의 발생으로 신종 또는 미보고 바이러스 발생이 늘어나고 있지만, 콩과 같은 주요 작물의 병해 발생 상황 및 피해 양상 구명에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이러한 이유로 국내 콩에서 발생하는 바이러스 병해의 확인을 위해 2012~2014년도에 8도 19~20지역에서 시료를 채집하였다. 채집된 시료들은 21종(SMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV, BCMV, SbDV, AMV, CMV, CPMV, CCMV, CPMoV, BPMV, CPSMV, PEMV, BBWV2, TSV, TRSV, BYMV, SBMV)에 대한 정밀 진단을 위하여 각각의 대상바이러스 종 특이적 진단용 primer를 이용하여 RT-PCR 진단이 수행하였다. 2012년도에는 260점의 시료 중에서 245점(94.2%)에서 바이러스가 검출되었으며, 20점(6.7%) 시료가 바이러스 복합감염으로 확인되었다. 2013년도에는 356개의 시료 중에서 74.2%에서 바이러스가 검출되었으며, 21.1%인 75개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다. 2014년도에는 319개의 시료 중에서 80.9%에서 바이러스가 검출되었으며, 26.0%인 83개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다. 2015년도에는 258개의 시료 중에서 97.3%에서 바이러스가 검출되었으며, 48.1%인 124개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다.채집된 시료들의 유전자 분석을 통한 계통분석을 위해 SMV의 CI 유전자와 SMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV, BCMV, SbDV의 외피단백질 유전자 분석을 통해 계통분석을 실시하였다. 그리고 2012년~2014년에 지역별로 채집된 바이러스들의 유전자 특성 분석을 위하여 각각의 바이러스 외피단백질 유전자에 대한 특이 primer를 설계하고, 결정된 유전자들의 상동성 비교를 실시하였다. 유전적 분석을 통해 채집된 시료의 지역적, 연도별, 나라별 차이를 확인하여 계통분석을 하고자 하였다. 지역적으로 분리된 SMV의 시료들을 분석한 결과 G1, G2, G7A는 확인되지 않았으며, G7H(34.3%), G5(30.8%), G4(18.9%)가 전국적으로 우점하는 것으로 확인되었다. SMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 88.8~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 90.2~100%로 확인되었다. SYCMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 73.7~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 74.6~100%로 확인되었다. PeMoV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 95.8~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들 간에는 98.1~100%로 확인되었다. PSV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 66.2~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 97.9~99.9%로 확인되었다. BCMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 85.4~92%로 확인되었다. SbDV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 88.7~100%로 확인되었다. 분리된 바이러스들의 생물학적 특성 검정을 위하여 122~128개 주요 품종 및 교배모본에 SYCMV, PeMoV, BCMV와 PSV를 인공접종하여 그 반응을 확인하였다. SYCMV의 저항성 검정을 위해 122개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, mild mosaic, mottle 및 mild-mottle의 병징이 확인되었으며, 14품종에서 저항성이 108품종에서 감수성이 확인되었다. PeMoV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic과 vein necrosis의 병징이 확인되었으며, 88품종에서 저항성이 40품종에서 감수성이 확인되었다. BCMV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, vein necrosis 및 necrosis의 병징이 확인되었으며, 66품종에서 저항성이 62품종에서 감수성이 확인되었다. PSV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, vein necrosis 및 necrosis의 병징이 확인되었으며, 99품종에서 저항성이 29품종에서 감수성이 확인되었다.
현재 국내에서 사용되고 있는 몇 가지 바이러스 진단방법은 ELISA, RT-PCR, Real time-PCR, DNA-chip 등이 이용되어 왔다. 이들 방법의 경우 특정 바이러스의 확인이 주가 되어 수행되는 방법이었으나, 예상하지 못한 바이러스에 대한 진단과 관리에는 어려움이 있었다. 기존 바이러스 동정기법의 한계를 극복하기 위해 NGS 기반의 집단 전사체를 이용하여 바이러스 등 병원체 진단을 통하여, 신, 변종 바이러스를 효율적으로 동정하고자 하는 노력이 최근 다방면에서 이루어지고 있다. 이번연구에서는 대구 하빈에서의 육종포장에서 발생하는 바이러스의 유전체 분석을 위해 약 3000개체의 시료를 1차로, 2012∼2014년 전국적으로 채집된 미확인 채집시료를 2차로하여 이들의 RNA를 pooling하여 분석에 이용하였다. 1차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 1,000bp 이상의 유전정보를 BLAST 한 결과 Bean common mosaic virus 12개, Bean yellow mosaic virus 6개, Soybean mild mottle virus 6개로 70.6%를 차지하였다. 1차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 1,000bp 이하의 유전정보를 BLSAT 한 결과 Bean common mosaic virus 22개, Bean yellow mosaic virus 18개, Faba bean necrotic yellow virus 5개로 86.5%를 차지하였다. 2차 시료의 수집된 자료에서 바이러스 유래 유전정보를 BLSAT 한 결과 Soybean mosaic virus 23개, Alfalfa mosaic virus 20개, Bean common mosaic virus 19개, Glycine max virus 15개, Peanut stunt virus 11개로 80%를 차지하였다. 지금까지 BCMV, AMV, PSV는 종특이 진단 priemr를 이용하여 RT-PCR 진단을 통해 채집된 시료들을 분석하였다. 하지만, 2012년~2015년까지 채집된 시료에서 AMV는 지금까지 검출되지 않았으며, BCMV와 PSV는 확인은 되나 많은 비율을 차지하지 못하였다. 위의 결과를 보았을 때 이들 바이러스들의 변이종이 많이 존재하는 것으로 추측된다. 1차, 2차 시료들의 분석 정보를 확인한 결과 BBWV, BPMV, BSBV, BYMV, MYMV 등과 같은 국내 미보고 종들이 다수 존재할 것으로 예상된다.국내 콩에서는 SMV, SbDV, AMV, CMV, CPMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV와 BCMV가 보고되었다. 과거 이들 바이러스 중에서 SMV가 심각한 피해를 입히고 있으며, 90%이상 우점하는 것으로 보고되었다. 하지만, 최근 SMV의 발생률은 30% 정도로 낮아졌으며, SYMMV, SYCMV와 PSV 등 신문제 바이러스 병해가 피해를 주고 있는 것으로 확인되었다. 최근 기후 및 재배환경의 변화와 국제 농산물 교역으로 인해 병 발생 양상이 급속하게 변하고 있음을 나타내는 단적인 예인 것이다. 또한, 새로운 매개충과 전염원의 발생으로 신종 또는 미보고 바이러스 발생이 늘어나고 있지만, 콩과 같은 주요 작물의 병해 발생 상황 및 피해 양상 구명에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이러한 이유로 국내 콩에서 발생하는 바이러스 병해의 확인을 위해 2012~2014년도에 8도 19~20지역에서 시료를 채집하였다. 채집된 시료들은 21종(SMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV, BCMV, SbDV, AMV, CMV, CPMV, CCMV, CPMoV, BPMV, CPSMV, PEMV, BBWV2, TSV, TRSV, BYMV, SBMV)에 대한 정밀 진단을 위하여 각각의 대상바이러스 종 특이적 진단용 primer를 이용하여 RT-PCR 진단이 수행하였다. 2012년도에는 260점의 시료 중에서 245점(94.2%)에서 바이러스가 검출되었으며, 20점(6.7%) 시료가 바이러스 복합감염으로 확인되었다. 2013년도에는 356개의 시료 중에서 74.2%에서 바이러스가 검출되었으며, 21.1%인 75개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다. 2014년도에는 319개의 시료 중에서 80.9%에서 바이러스가 검출되었으며, 26.0%인 83개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다. 2015년도에는 258개의 시료 중에서 97.3%에서 바이러스가 검출되었으며, 48.1%인 124개 시료가 바이러스 복합감염으로 나타났다.채집된 시료들의 유전자 분석을 통한 계통분석을 위해 SMV의 CI 유전자와 SMV, SYMMV, SYCMV, PSV, PeMoV, BCMV, SbDV의 외피단백질 유전자 분석을 통해 계통분석을 실시하였다. 그리고 2012년~2014년에 지역별로 채집된 바이러스들의 유전자 특성 분석을 위하여 각각의 바이러스 외피단백질 유전자에 대한 특이 primer를 설계하고, 결정된 유전자들의 상동성 비교를 실시하였다. 유전적 분석을 통해 채집된 시료의 지역적, 연도별, 나라별 차이를 확인하여 계통분석을 하고자 하였다. 지역적으로 분리된 SMV의 시료들을 분석한 결과 G1, G2, G7A는 확인되지 않았으며, G7H(34.3%), G5(30.8%), G4(18.9%)가 전국적으로 우점하는 것으로 확인되었다. SMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 88.8~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 90.2~100%로 확인되었다. SYCMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 73.7~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 74.6~100%로 확인되었다. PeMoV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 95.8~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들 간에는 98.1~100%로 확인되었다. PSV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 66.2~100%로 나타났으며, 채집된 분리주들간에는 97.9~99.9%로 확인되었다. BCMV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 85.4~92%로 확인되었다. SbDV의 분석된 염기서열들 사이에 상동성은 88.7~100%로 확인되었다. 분리된 바이러스들의 생물학적 특성 검정을 위하여 122~128개 주요 품종 및 교배모본에 SYCMV, PeMoV, BCMV와 PSV를 인공접종하여 그 반응을 확인하였다. SYCMV의 저항성 검정을 위해 122개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, mild mosaic, mottle 및 mild-mottle의 병징이 확인되었으며, 14품종에서 저항성이 108품종에서 감수성이 확인되었다. PeMoV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic과 vein necrosis의 병징이 확인되었으며, 88품종에서 저항성이 40품종에서 감수성이 확인되었다. BCMV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, vein necrosis 및 necrosis의 병징이 확인되었으며, 66품종에서 저항성이 62품종에서 감수성이 확인되었다. PSV의 저항성 검정을 위해 128개 품종에 인공접종을 실시한 결과 mosaic, vein necrosis 및 necrosis의 병징이 확인되었으며, 99품종에서 저항성이 29품종에서 감수성이 확인되었다.
It had been reported that ten different viral diseases, such as alfalfa mosaic virus (AMV), bean common mosaic virus (BCMV), cucumber mosaic virus (CMV), cowpea mosaic virus (CPMV), peanut mottle virus (PeMoV), peanut stunt virus (PSV), soybean dwarf virus (SbDV), soybean mosaic virus (SMV), soybean...
It had been reported that ten different viral diseases, such as alfalfa mosaic virus (AMV), bean common mosaic virus (BCMV), cucumber mosaic virus (CMV), cowpea mosaic virus (CPMV), peanut mottle virus (PeMoV), peanut stunt virus (PSV), soybean dwarf virus (SbDV), soybean mosaic virus (SMV), soybean yellow common mosaic virus (SYCMV), and soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), damage on soybean in Korea. Among them, SMV has been known to be a dominant viral disease and caused severe damage in soybean for decades. However, recent survey data have indicated that several domestically unreported and new species of soybean viruses, such as PSV, SbDV, SYMMV, and SYCMV, seem to be emerging in soybean fields. To further study the distribution and incidence of soybean viral diseases, nationwide survey has been conducted throughout year 2012~2015. The soybean samples with symptoms supposedly caused by viruses were collected from 19~20 areas of 8 provinces and analyzed to understand the circumstances of viral diseases in soybean fields. In present, there are 11 SMV strains damaging in soybean. The survey in this study indicates that G5, G7H, and G4 are found to be dominant by RT-PCR/RFLP analysis of CI gene. Unlike previous report that SMV was a dominant viral disease, the survey data indicated that the dominant viral diseases were both SYMMV and SYCMV, recently reported new species of soybean viruses. This result can be speculated by the overestimated breeding programs for SMV and the consequence increase of other viral diseases in soybean fields. To screen the genetic resources to confer resistance for emerging viruses, 128 cultivars were challenged to infect SYCMV, PeMoV, PSV, or BCMV and the resources were subsequently obtained for each virus. In addition, a frontier technology, meta-transcriptome analysis, one of the next-generation sequencing (NGS) technic, has been adopted to understand soybean viruses with previously unknown pre-sequence information. The soybean samples were collected from both breeding and farmer’s fields and subjected to meta-transcriptome analysis. Previously unknown SMV-like potyvirus having 80% identity to the nucleotide sequence of RNA genome of SMV was identified. The other achievement is that BCMV causing disease in soybean has highly variable nucleotide sequences of RNA genome differing from the virus found in other legume plants. Taken togather, the results in this study could provide overall status of previously known and newly identified soybean viral diseases by adopting conventional and frontier technologies and the genetic resources conferring resistance to emerging viral diseases for soybean breeders.
It had been reported that ten different viral diseases, such as alfalfa mosaic virus (AMV), bean common mosaic virus (BCMV), cucumber mosaic virus (CMV), cowpea mosaic virus (CPMV), peanut mottle virus (PeMoV), peanut stunt virus (PSV), soybean dwarf virus (SbDV), soybean mosaic virus (SMV), soybean yellow common mosaic virus (SYCMV), and soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), damage on soybean in Korea. Among them, SMV has been known to be a dominant viral disease and caused severe damage in soybean for decades. However, recent survey data have indicated that several domestically unreported and new species of soybean viruses, such as PSV, SbDV, SYMMV, and SYCMV, seem to be emerging in soybean fields. To further study the distribution and incidence of soybean viral diseases, nationwide survey has been conducted throughout year 2012~2015. The soybean samples with symptoms supposedly caused by viruses were collected from 19~20 areas of 8 provinces and analyzed to understand the circumstances of viral diseases in soybean fields. In present, there are 11 SMV strains damaging in soybean. The survey in this study indicates that G5, G7H, and G4 are found to be dominant by RT-PCR/RFLP analysis of CI gene. Unlike previous report that SMV was a dominant viral disease, the survey data indicated that the dominant viral diseases were both SYMMV and SYCMV, recently reported new species of soybean viruses. This result can be speculated by the overestimated breeding programs for SMV and the consequence increase of other viral diseases in soybean fields. To screen the genetic resources to confer resistance for emerging viruses, 128 cultivars were challenged to infect SYCMV, PeMoV, PSV, or BCMV and the resources were subsequently obtained for each virus. In addition, a frontier technology, meta-transcriptome analysis, one of the next-generation sequencing (NGS) technic, has been adopted to understand soybean viruses with previously unknown pre-sequence information. The soybean samples were collected from both breeding and farmer’s fields and subjected to meta-transcriptome analysis. Previously unknown SMV-like potyvirus having 80% identity to the nucleotide sequence of RNA genome of SMV was identified. The other achievement is that BCMV causing disease in soybean has highly variable nucleotide sequences of RNA genome differing from the virus found in other legume plants. Taken togather, the results in this study could provide overall status of previously known and newly identified soybean viral diseases by adopting conventional and frontier technologies and the genetic resources conferring resistance to emerging viral diseases for soybean breeders.
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