수막구균은 캡슐에 있는 특이적 당 구조에 따라 13 가지 혈청군으로 분류되며, 수막구균 백신은 침습적 질환을 일으키는 혈청군의 특이적인 다당류들을 기반하여 만들어진다. 따라서 WHO는 수막구균 백신의 품질, 안정성, 유효성을 평가하기 위한 방법으로 수막구균의 다당류 함량 측정을 권고하고 있다. 수막구균 백신의 경우, 생물학적제제로써 국내 유통 전 국가출하승인 검정시험을 거쳐야 하며 국가출하승인 검정시험 항목으로 유리 다당류 와 총 다당류에 대한 다당류 함량 시험이 수행되고 있으나, 현재까지 국가출하승인 공식시험법이 없어 제조사의 시험법에 따라 시험을 진행하고 있다. 국내 허가된 수막구균 백신 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 경우, 다당류 함량 측정을 위해 HPAEC-PAD를 이용한 ...
수막구균은 캡슐에 있는 특이적 당 구조에 따라 13 가지 혈청군으로 분류되며, 수막구균 백신은 침습적 질환을 일으키는 혈청군의 특이적인 다당류들을 기반하여 만들어진다. 따라서 WHO는 수막구균 백신의 품질, 안정성, 유효성을 평가하기 위한 방법으로 수막구균의 다당류 함량 측정을 권고하고 있다. 수막구균 백신의 경우, 생물학적제제로써 국내 유통 전 국가출하승인 검정시험을 거쳐야 하며 국가출하승인 검정시험 항목으로 유리 다당류 와 총 다당류에 대한 다당류 함량 시험이 수행되고 있으나, 현재까지 국가출하승인 공식시험법이 없어 제조사의 시험법에 따라 시험을 진행하고 있다. 국내 허가된 수막구균 백신 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 경우, 다당류 함량 측정을 위해 HPAEC-PAD를 이용한 분석법이 사용된다. 그러나 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 기존 시험법은, 시료의 전처리 및 분석 장비의 조작 및 유지가 까다롭고, 내부표준품이 없어 시험결과의 재현성이 낮은 단점이 있다. 또한 혈청군 C형과 혈청군 W135, Y형 다당류 분석이 따로 이루어지므로 시험에 장시간이 소요된다는 단점이 있다. 따라서 본 연구는 해당 백신의 혈청군 C, W135, Y형의 총 다당류 함량시험에 대한 기간을 단축하고 시험의 재현성을 높일 수 있는 동시분석법을 개발하여 국가출하승인검정 시험에 활용하는 것을 목표로 수행되었다. 동시분석법을 개발하기 위하여 크게 2 단계로 연구를 수행하였다. 우선, 기존 시험법의 문제점을 보완하여 혈청군 C, W135, Y에 대한 총 다당류 함량 동시분석법을 설계하였다. 이를 위해 내부표준품 및 정량표준품을 선정하고 이를 이용해 새로운 표준곡선을 세팅하였다. 또한 기존 문헌을 바탕으로 세 가지 혈청군에 대하여 동시에 양성대조표준품에 가까운 회수율을 가질 수 있는 가수분해 조건을 설정하고 이를 바탕으로 SOP(안) 등을 제작하였다. 다음으로, 개발된 동시분석시험법에 대한 밸리데이션을 수행하여 동시분석법의 타당성을 검증하였다. 연구 결과, 내부 표준품으로 Fucose를 선정하고 각 혈청군에 대한 정량 표준품을 제조하여 동시분석법을 위한 새로운 표준곡선을 세팅하였다. 또한 세 가지 혈청군에 대한 공통 가수분해 조건으로 (2 M, 90 ℃, 2h 30 min)을 찾았다. 개발된 동시분석법은 ICH 가이드라인과 국제조화된 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인’에 따라 정확성, 직선성, 특이성, 정밀성, 범위, 완건성의 6 가지 파라미터를 통해 평가되었으며, 모든 항목에서 기준을 만족하였다. 이로써, 다당류 함량 측정을 위해 본 연구에서 개발된 동시분석법은 해당 백신에 대한 시험 시간을 효과적으로 단축하고 시험의 재현성을 높였음을 확인할 수 있었다. 궁극적으로, 개발된 동시분석법을 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 국가검정시험에 적용할 수 있음을 확인하였다.
수막구균은 캡슐에 있는 특이적 당 구조에 따라 13 가지 혈청군으로 분류되며, 수막구균 백신은 침습적 질환을 일으키는 혈청군의 특이적인 다당류들을 기반하여 만들어진다. 따라서 WHO는 수막구균 백신의 품질, 안정성, 유효성을 평가하기 위한 방법으로 수막구균의 다당류 함량 측정을 권고하고 있다. 수막구균 백신의 경우, 생물학적제제로써 국내 유통 전 국가출하승인 검정시험을 거쳐야 하며 국가출하승인 검정시험 항목으로 유리 다당류 와 총 다당류에 대한 다당류 함량 시험이 수행되고 있으나, 현재까지 국가출하승인 공식시험법이 없어 제조사의 시험법에 따라 시험을 진행하고 있다. 국내 허가된 수막구균 백신 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 경우, 다당류 함량 측정을 위해 HPAEC-PAD를 이용한 분석법이 사용된다. 그러나 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 기존 시험법은, 시료의 전처리 및 분석 장비의 조작 및 유지가 까다롭고, 내부표준품이 없어 시험결과의 재현성이 낮은 단점이 있다. 또한 혈청군 C형과 혈청군 W135, Y형 다당류 분석이 따로 이루어지므로 시험에 장시간이 소요된다는 단점이 있다. 따라서 본 연구는 해당 백신의 혈청군 C, W135, Y형의 총 다당류 함량시험에 대한 기간을 단축하고 시험의 재현성을 높일 수 있는 동시분석법을 개발하여 국가출하승인검정 시험에 활용하는 것을 목표로 수행되었다. 동시분석법을 개발하기 위하여 크게 2 단계로 연구를 수행하였다. 우선, 기존 시험법의 문제점을 보완하여 혈청군 C, W135, Y에 대한 총 다당류 함량 동시분석법을 설계하였다. 이를 위해 내부표준품 및 정량표준품을 선정하고 이를 이용해 새로운 표준곡선을 세팅하였다. 또한 기존 문헌을 바탕으로 세 가지 혈청군에 대하여 동시에 양성대조표준품에 가까운 회수율을 가질 수 있는 가수분해 조건을 설정하고 이를 바탕으로 SOP(안) 등을 제작하였다. 다음으로, 개발된 동시분석시험법에 대한 밸리데이션을 수행하여 동시분석법의 타당성을 검증하였다. 연구 결과, 내부 표준품으로 Fucose를 선정하고 각 혈청군에 대한 정량 표준품을 제조하여 동시분석법을 위한 새로운 표준곡선을 세팅하였다. 또한 세 가지 혈청군에 대한 공통 가수분해 조건으로 (2 M, 90 ℃, 2h 30 min)을 찾았다. 개발된 동시분석법은 ICH 가이드라인과 국제조화된 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인’에 따라 정확성, 직선성, 특이성, 정밀성, 범위, 완건성의 6 가지 파라미터를 통해 평가되었으며, 모든 항목에서 기준을 만족하였다. 이로써, 다당류 함량 측정을 위해 본 연구에서 개발된 동시분석법은 해당 백신에 대한 시험 시간을 효과적으로 단축하고 시험의 재현성을 높였음을 확인할 수 있었다. 궁극적으로, 개발된 동시분석법을 (A, C, W135, Y)-CRM197단백접합백신의 국가검정시험에 적용할 수 있음을 확인하였다.
Meningococcus is classified into 13 serogroups according to the specific sugar structure in the capsule, and the meningococcal vaccine is made based on the specific polysaccharides of the serogroup that causes invasive diseases. Therefore, WHO recommends measuring the polysaccharide content of menin...
Meningococcus is classified into 13 serogroups according to the specific sugar structure in the capsule, and the meningococcal vaccine is made based on the specific polysaccharides of the serogroup that causes invasive diseases. Therefore, WHO recommends measuring the polysaccharide content of meningococcal as a method to evaluate the quality, stability and effectiveness of meningococcal vaccine. In the case of meningococcal vaccine, as a biological product, it must undergo a national lot release before distribution in Korea. As a test item for national lot release, quantitation of free and total polysaccharide in vaccine is being performed, but until now, there is no official test method for national lot release. So the national lot release has been based on the manufacturer's test method. In the case of (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine, one of the domestically approved meningococcal vaccine, an analysis method using HPAEC-PAD is used to measure the polysaccharide quantity. However, the existing test method of (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine has disadvantages that it is difficult to manipulate and maintain sample pretreatment and analysis equipment, and there is no internal standard. For these reasons, the test result for quantitation of polysaccharide has low reproducibility. In addition, since the tests for serogroup C, W135, Y are performed separately, the test takes a long time. Therefore, this study was carried out with the aim of developing a simultaneous analytical method that can shorten the period of total polysaccharide content test for serogroup C, W135, Y and increase the reproducibility of the test result. In order to develop a simultaneous analytical method, research was carried out in two stages. First, a simultaneous analytical method for quantitation of polysaccharide of serogroups C, W135, Y was designed to complement the problems of the existing test methods. For this, internal standards and quantitative standards were selected and a new standard curve was set using quantitative standards. In addition, based on the existing literature, a hydrolysis condition for three serogroups was set and this can have a recovery close to that of a positive control standard. And SOP(draft) was produced based on this hydrolysis condition. Next, validation of the developed simultaneous analytical test method was performed to examine the feasibility of the simultaneous analytical method. As a result of the study, Fucose was selected as an internal standard, and a quantitative standard for each serogroup was prepared to set a new standard curve for the simultaneous analytical method. In addition, the common hydrolysis condition for the three serogroups was found (2 M, 90 ℃, 2h 30 min). The developed simultaneous analytical method was evaluated by six validation parameters of accuracy, linearity, specificity, precision, range, and robustness in accordance with guidelines for validation of drug testing methods, internationally harmonized with the ICH. As a result, all criteria of validation parameters were satisfied. Accordingly, the simultaneous analytical method developed in this study effectively shortened the test time for quantitation of total polysaccharide and improved the reproducibility of the test. Ultimately, the developed simultaneous analytical method can be applied to lot release for the (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine.
Meningococcus is classified into 13 serogroups according to the specific sugar structure in the capsule, and the meningococcal vaccine is made based on the specific polysaccharides of the serogroup that causes invasive diseases. Therefore, WHO recommends measuring the polysaccharide content of meningococcal as a method to evaluate the quality, stability and effectiveness of meningococcal vaccine. In the case of meningococcal vaccine, as a biological product, it must undergo a national lot release before distribution in Korea. As a test item for national lot release, quantitation of free and total polysaccharide in vaccine is being performed, but until now, there is no official test method for national lot release. So the national lot release has been based on the manufacturer's test method. In the case of (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine, one of the domestically approved meningococcal vaccine, an analysis method using HPAEC-PAD is used to measure the polysaccharide quantity. However, the existing test method of (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine has disadvantages that it is difficult to manipulate and maintain sample pretreatment and analysis equipment, and there is no internal standard. For these reasons, the test result for quantitation of polysaccharide has low reproducibility. In addition, since the tests for serogroup C, W135, Y are performed separately, the test takes a long time. Therefore, this study was carried out with the aim of developing a simultaneous analytical method that can shorten the period of total polysaccharide content test for serogroup C, W135, Y and increase the reproducibility of the test result. In order to develop a simultaneous analytical method, research was carried out in two stages. First, a simultaneous analytical method for quantitation of polysaccharide of serogroups C, W135, Y was designed to complement the problems of the existing test methods. For this, internal standards and quantitative standards were selected and a new standard curve was set using quantitative standards. In addition, based on the existing literature, a hydrolysis condition for three serogroups was set and this can have a recovery close to that of a positive control standard. And SOP(draft) was produced based on this hydrolysis condition. Next, validation of the developed simultaneous analytical test method was performed to examine the feasibility of the simultaneous analytical method. As a result of the study, Fucose was selected as an internal standard, and a quantitative standard for each serogroup was prepared to set a new standard curve for the simultaneous analytical method. In addition, the common hydrolysis condition for the three serogroups was found (2 M, 90 ℃, 2h 30 min). The developed simultaneous analytical method was evaluated by six validation parameters of accuracy, linearity, specificity, precision, range, and robustness in accordance with guidelines for validation of drug testing methods, internationally harmonized with the ICH. As a result, all criteria of validation parameters were satisfied. Accordingly, the simultaneous analytical method developed in this study effectively shortened the test time for quantitation of total polysaccharide and improved the reproducibility of the test. Ultimately, the developed simultaneous analytical method can be applied to lot release for the (A, C, W135, Y)-CRM197 protein conjugate vaccine.
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