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문제 정의
- 이러한 내인성물질의 규명을 위한 연구의 한 방법으로 전통약제들 중 진정수면제 및 항경련제를 대상으로 전통약제의 구성 단일성분들 중 항불안, 항경련 및 진정작용을 갖는 단일성분을 추적 중에 있다. 이러한 목적의 초보 단계로 본 연구가 고안되었으며, 본 연구에서는 홍삼사포닌분획의 항불안작용을 검색하고 benzodiazepine 수용체에 대한 수용체 결합력을 관찰하기 위하여, 백서의 대뇌피질을 검체로 하여 benzodiazepine 수용체에 대한 [3H] Ro 15-1788 결합반응을 실시하였다.
- 이에 본 연구는 홍삼의 전 사포닌(total saponin, TS)을 사용 하여 실험동물에서 항불안작용을 검색하고 이들의 작용을 benzodiazepine의 대표적 약물인 diazepam의 효과와 비교하고자 함이며, 아울러 이러한 작용기전을 규명하기 위하여 홍삼 사포닌의 benzodiazepine 수용체와의 상호작용을 관찰하기 위함이다.
제안 방법
- Benzodiazepine 수용체에 대한 선택적 길항제인 [3H] Ro15-1788의 결합반응에서 각 홍삼사포닌분획에 함유되어 있는 수용체에 대한 억제성물질의 총량의 측정은 동일한 조건하에서 이루어진 이미 알고 있는 용량의 diazepam 을 사용하여 실험 결과 얻어진 competition curve를 비교, 분석하여 계산하였다. 각 사포닌 분획내의 수용체활성도(inhibitory activity)의 총량은‘diazepam equivalent’(ng diazepam/mg saponin fraction weight)로 표시하였다.
- Maze는 두 개의 개방된 경로(open arm：길이 25cm, 폭 5cm)과 높이 35cm의 벽을 가지고 있는 폐쇄경로(closed arm：같은 크기)가 수평으로 교차되어 있으며, 이 십자 경로의 바닥으로부터 50cm의 높이에 위치하고 있어 실험 동물로 하여금 불안을 야기하도록 고안되었다. 각 군의 실험 동물을 십자로의 중앙에 위치시키고 개방 및 폐쇄경로로의 진입 회수 및 각 경로에서의 소요 시간을 plus maze monitoring program(Elevated Plus maze, Vatican Production, Inc)를 사용하여 5분동안 측정하였다. 개방경로로의 진입수(entry)의 감소 및 소요 시간(retention time)의 감소를 불안의 증가로 판정하였다.
- Benzodiazepine 수용체 표본 제작을 위하여 흰쥐(웅성, 250∼300g, Sprague-Dawley)는 단두하여 희생시켜, 즉시 대뇌피질 조직을 분리하였다. 대뇌피질조직은 무게를 잰 후 50배 부피의 50mM Tris-citrate 완충용액(pH＝7.4)에서 균질화(Homogenization)하였다. 균질화한 조직은 원심분리기(20,000g, 4℃, Beckman, USA)를 사용하여 20분간 원심분리시킨 후 그 결과 생겨나는 pellet은 다시 50배 부피의 Tris-Citrate 완충용액에 재분배하였다.
- 중추신경계에 작용하여 진정효과를 나타내는 약물 중 특히 항불안제의 작용에 관여하는 신경전달물질 수용체로 현재까지 가장 주목을 받고 있는 것은 GABA A-benzodiazepine 수용체-chloride통로 복합체에 있는 benzodiazepine 수용체이다. 본 실험 결과 관찰한 홍삼 사포닌의 항불안작용의 기전 규명을 위한 접근 방법으로 홍삼 사포닌의 benzodiazepine 수용체에 대한 수용체 결합력을 관찰하고자, 흰쥐의 대뇌 피질을 검체로 하여 benzodiazepine 수용체에 대한 [3H] Ro15-1788 결합 실험을 실시하였다. 홍삼 사포닌 분획들은 benzodiazpine 수용체에 결합하는 반응성을 보였으며, ginsenoside Rb, Re 및 Rd등의 함량이 높은 TSIV 분획이 가장 높은 결합력을 나타내었는데, 이 분획에서는 항불안 작용을 관찰할 수 없었다.
- 홍삼사포닌의 투여는 주 1회 매주 같은 날에 실시하였다. 사포닌분획을 실험 30분전에 10마리의 생쥐 각각에게 복강내 주사하였으며, 나머지 한 마리에게는 위약(placebo)을 투여하였다. 실험동물의 약물반응에 대한 개체간 차이를 줄이기 위하여 매 실험마다 한 생쥐가 같은 약물을 투여받지 않도록 서로 바꾸어가며 투여하였으며, 실험기간 중 꼭 한 번은 위약을 투여받도록 하여 한 생쥐가 모든 사포닌분획과 위약을 투여받을 수 있도록 하였다.
- 실험동물의 약물반응에 대한 개체간 차이를 줄이기 위하여 매 실험마다 한 생쥐가 같은 약물을 투여받지 않도록 서로 바꾸어가며 투여하였으며, 실험기간 중 꼭 한 번은 위약을 투여받도록 하여 한 생쥐가 모든 사포닌분획과 위약을 투여받을 수 있도록 하였다. 사포닌분획의 공급은 생리식염수에 용해시켜 실시하였으며, 실험은 월요일부터 금요일까지 주 5회 매일 같은 시간대에 실시하였다. 홍삼사포닌분획대신 이미 임상에서 항불안제로 사용되고 있는 diazepam을 동일한 투여 방법으로 투여 후 elevated plus maze 검사를 실시하여 그 작용양상을 비교하였다.
- 실험동물에서 항불안효과의 검정을 위하여 생쥐에게 각각 상이한 단일성분 함량을 지닌 여러분획들을 투여 후 elevated plus maze법을 사용하여 항불안효과를 비교, 관찰하였다. 실험결과 홍삼 ginsenoside Rg1, Rf 및 Re 등의 함량이 보다 높은 TSI 분 획에서 항불안 효과를 관찰하였다.
- 사포닌분획을 실험 30분전에 10마리의 생쥐 각각에게 복강내 주사하였으며, 나머지 한 마리에게는 위약(placebo)을 투여하였다. 실험동물의 약물반응에 대한 개체간 차이를 줄이기 위하여 매 실험마다 한 생쥐가 같은 약물을 투여받지 않도록 서로 바꾸어가며 투여하였으며, 실험기간 중 꼭 한 번은 위약을 투여받도록 하여 한 생쥐가 모든 사포닌분획과 위약을 투여받을 수 있도록 하였다. 사포닌분획의 공급은 생리식염수에 용해시켜 실시하였으며, 실험은 월요일부터 금요일까지 주 5회 매일 같은 시간대에 실시하였다.
- 반응 혼합물이 든 시험관들은 실온에서 한시간 방치한 후 GF/ B 여과지상에서 Brandel M-24R(Brandel Instruments, Gaithersberg, MD, USA)을 사용하여 결합분획과 비결합분획을 신속히 분리하였다. 여과지상의 결합분획이 내는 방사성 활성도는 liquid scintillation counter(Beckman LS 5801)을 사용하여 측정하였다. 제작한 대뇌피질조직의 단백질 함량은 bicinchoninic acid법(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 측정하였다.
- 행동검사를 위해서는 생쥐(ICR)를 사용하였으며, 실험군은 대 조군, 홍삼사포닌분획 50mg/kg 투여군 및 diazepam 1mg/kg 및 0.5mg/kg 투여군이었다. 홍삼사포닌의 투여는 주 1회 매주 같은 날에 실시하였다.
- 사포닌분획의 공급은 생리식염수에 용해시켜 실시하였으며, 실험은 월요일부터 금요일까지 주 5회 매일 같은 시간대에 실시하였다. 홍삼사포닌분획대신 이미 임상에서 항불안제로 사용되고 있는 diazepam을 동일한 투여 방법으로 투여 후 elevated plus maze 검사를 실시하여 그 작용양상을 비교하였다.
- 홍삼사포닌분획의 항불안작용의 양상을 검색하고자 사포닌분 획을 사용하여 실험 동물에서 항불안작용을 검색하고 이들의 작용을 benzodiazepine의 대표적 약물인 diazepam의 효과와 비교하여 보았다.
- 5mg/kg 투여군이었다. 홍삼사포닌의 투여는 주 1회 매주 같은 날에 실시하였다. 사포닌분획을 실험 30분전에 10마리의 생쥐 각각에게 복강내 주사하였으며, 나머지 한 마리에게는 위약(placebo)을 투여하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Scintialltion cocktail은 Packard사(Packard instrument B.V. Chemical operations, groningen, Netherlands)에서 구입하였다. 제작한 각종 조직표본의 단백질정량을 위하여 bicinchoninic acid 정량 kit을 Pierce사(Rockford, IL, USA)로부터 구입 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 약물 중 방사성 동위원소는 Dupont-NEN(Boston, MA, USA)사에서 구입하였으며, diazepam 및 Ro 14-7437은 Roche사 제품을 사용하였다. Tris, citric acid, polyethyleneamine, sucrose등의 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Scintialltion cocktail은 Packard사(Packard instrument B.
- 본 실험에 사용된 약물 중 방사성 동위원소는 Dupont-NEN(Boston, MA, USA)사에서 구입하였으며, diazepam 및 Ro 14-7437은 Roche사 제품을 사용하였다. Tris, citric acid, polyethyleneamine, sucrose등의 시약은 Sigma사(St.
- 실험에 사용된 홍삼사포닌분획은 한국인삼연초연구원(품질검증실) 6년근 고려 홍삼으로부터 추출 또는 분리한 것을 사용하였다. 홍삼사포닌분획은 80% methanol로 추출하여 메탄올엑스를 얻는 다음 ether로 추출하여 탈지시키고 수포화 n-butanol로 추출 농축한 것으로서 주종 ginsenosides는 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2등이 약 60% 함유되어 있는 사포닌혼합물로서 PD/ PT계 사포닌의 비율은 TSI이 1.
데이터처리
- 수용체 결합실험에서 얻어진 결과는 Inplot4(Graphpad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 nonlinear regression 시켜 분석하였다. EC50, Emax 변화의 통계학적 유의성검정은 ANOVA로 분석 후 Neuman-Keuls multiple comparision test(Systat, Intelligent Soft ware, Evanston, IL, USA)를 사용하였다.
- 행동학적 검색의 분석은 analysis of variance(ANOVA)를 이용하였으며, 각군간의 성적의 비교는 multiple comparision test를 이용하였다. 수용체 결합실험에서 얻어진 결과는 Inplot4(Graphpad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 nonlinear regression 시켜 분석하였다. EC50, Emax 변화의 통계학적 유의성검정은 ANOVA로 분석 후 Neuman-Keuls multiple comparision test(Systat, Intelligent Soft ware, Evanston, IL, USA)를 사용하였다.
- 행동학적 검색의 분석은 analysis of variance(ANOVA)를 이용하였으며, 각군간의 성적의 비교는 multiple comparision test를 이용하였다. 수용체 결합실험에서 얻어진 결과는 Inplot4(Graphpad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 nonlinear regression 시켜 분석하였다.
이론/모형
- 실험동물의 불안(anxiety) 정도를 측정하기 위하여 elevated plus maze 검사(Lister 1987；Pellow와 File 1986)를 실시하였다. Maze는 두 개의 개방된 경로(open arm：길이 25cm, 폭 5cm)과 높이 35cm의 벽을 가지고 있는 폐쇄경로(closed arm：같은 크기)가 수평으로 교차되어 있으며, 이 십자 경로의 바닥으로부터 50cm의 높이에 위치하고 있어 실험 동물로 하여금 불안을 야기하도록 고안되었다.
- 여과지상의 결합분획이 내는 방사성 활성도는 liquid scintillation counter(Beckman LS 5801)을 사용하여 측정하였다. 제작한 대뇌피질조직의 단백질 함량은 bicinchoninic acid법(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 05) 증가하였다(Table 1). 그러나 diazepam 0.5mg/kg를 투여 후 같은 실험을 실시하였을 때 개방 통로로의 진입 횟수(percent open crosses)는 53±1.3으로서 대조군의 40±2.5에 비하여 차이가 없었으며, 개방 통로에서의 체류 시간(Percent time in open)도 29±1.2으로서 대조군의 30±1.6에 비하여 차이가 없었다(Table 1).
- 15mg 단백에 해당), 50μl의 방사성 동위 원소와 50μl의 각종 약물(홍삼사포닌분획 포함)을 사용하며, 50mM Tris-Citrate 완충용액을 첨가하여 총 부피 500μl가 되게 하였다. 비특이적(nonspecific) 결합반응을 위하여 10μM의 Ro 14-7437을 사용하였으며 그 결과 총 결합치의 10% 미만이 산출되게 하였다. 모든 assay는 triplicate로 하여 적어도 한 실험을 6회 이상 반복하였다.
- 생리적 식염수를 동일 부피 주사후 같은 실험을 실시한 실험군의 개방통로로의 진입 횟수(percent open crosses)는 51±1.3으로서 대조군의 40±2.5에 비하여 차이가 없었으며, 개방통로에서의 체류 시간(Percent time in open)도 30±1.7으로서 대조군의 30±1.6에 비하여 차이가 없었다(Table 1).
- 지금까지 인삼의 중추 억제적 효과와 관련된 항불안작용에 대한 연구보고(Chong과 Oberholzer 1988；Fulder 1980)에 의하면 임상에서 이미 항불안제로 널리 사용되고 있는 benzodiazpine계 약물과 유사한 항불안양상을 가지며, benzodiazepine의 문제점인 sedation, 운동기능저하 및 기억장애등의 부작용을 나타내지 않는 점에서 오히려 장점이 있어, 노년층의 행동을 정상화시키고, 직업적 stress하에서 작업능력을 향상시킬 수 있다고 하였다. 실험 결과 ginsenoside Rg1, Rf 및 Re등의 함량이 보다 높은 TSI 분획은 elevated plus maze 검사에서 우수한 항불안효과를 나타내었다.
- 실험동물에서 항불안효과의 검정을 위하여 생쥐에게 각각 상이한 단일성분 함량을 지닌 여러분획들을 투여 후 elevated plus maze법을 사용하여 항불안효과를 비교, 관찰하였다. 실험결과 홍삼 ginsenoside Rg1, Rf 및 Re 등의 함량이 보다 높은 TSI 분 획에서 항불안 효과를 관찰하였다.
- 홍삼 사포닌 분획들은 benzodiazpine 수용체에 결합하는 반응성을 보였으며, ginsenoside Rb, Re 및 Rd등의 함량이 높은 TSIV 분획이 가장 높은 결합력을 나타내었는데, 이 분획에서는 항불안 작용을 관찰할 수 없었다. 이상의 결과에서 볼 때 홍삼사포닌은 항불안작용을 나타내었으며, 이 항불안작용과 benzodiazepine 수용체에 대한 결합력과의 연관성은 관찰되지 않았다.
- 정상 생쥐에게 diazepam 1mg/kg을 복강내 주사후 30분에 elevated plus maze를 실시하였을 때 개방통로로의 진입횟수(percent open crosses)는 85±3.5으로서 대조군의 40±2.5에 비하여 유의하게(p<0.05) 증가하였으며, 개방통로에서의 체류시간(Percent time in open)도 70±3.7으로서 대조군의 30±1.6에 비하여 유의하게(p<0.05) 증가하였다(Table 1). 그러나 diazepam 0.
- 본 실험 결과 관찰한 홍삼 사포닌의 항불안작용의 기전 규명을 위한 접근 방법으로 홍삼 사포닌의 benzodiazepine 수용체에 대한 수용체 결합력을 관찰하고자, 흰쥐의 대뇌 피질을 검체로 하여 benzodiazepine 수용체에 대한 [3H] Ro15-1788 결합 실험을 실시하였다. 홍삼 사포닌 분획들은 benzodiazpine 수용체에 결합하는 반응성을 보였으며, ginsenoside Rb, Re 및 Rd등의 함량이 높은 TSIV 분획이 가장 높은 결합력을 나타내었는데, 이 분획에서는 항불안 작용을 관찰할 수 없었다. 이상의 결과에서 볼 때 홍삼사포닌은 항불안작용을 나타내었으며, 이 항불안작용과 benzodiazepine 수용체에 대한 결합력과의 연관성은 관찰되지 않았다.
- 홍삼사포닌분획의 benzodiazepine 수용체에 대한 결합력은 TSI, II, III 및 IV에서 다 관찰되었으며, Ginsenosides Rb, Re 및 Rd 등의 함량이 높은 TSIV 분획의 가장 높은 결합력을 나타내었다. 그러나 elevated plus maze를 이용한 생체 실험결과에서 홍삼 사포닌의 항불안작용은 TSIV 분획에서는 관찰할 수 없었기에 홍삼사포닌분획의 항불안효과는 benzodiazepine 수용체 매개작용이 아닌 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 elevated plus maze를 이용한 생체 실험결과에서 홍삼 사포닌의 항불안작용은 TSIV 분획에서는 관찰할 수 없었기에 홍삼사포닌분획의 항불안효과는 benzodiazepine 수용체 매개작용이 아닌 것으로 생각된다. 향후 glycine 수용체나 serotonin 수용체를 비롯한 다른 항불안작용 매개 수용체와의 상호작용의 검색이 필요하며, 이러한 연구는 홍삼사포닌의 항불안작용기전을 규명하는데 도움을 줄 것으로 생각된다.
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