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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 실제 공장에서 만들고 있는Aspergillus oryzae를 접종한 A구를 control 하고 Aspergillus oryzae와 Bacillus licheniformis를 혼용한 B구, Aspergillus oryzae와 Bacillus licheniformis 및 Sacchammyces rouxii를 혼용한 C구를 제조하여 이 세구간 간의 숙성중 미생물과 효소력의 변화를 비교 검토하였다.
제안 방법
- 숙성 기간 중 30일 간격으로 채취한 고추장 20g에 멸균된 증류수 180mL를 넣고 상온에서 2시간 진탕후 살균수에 104~108 범위로 단계 희석시킨 후, 미리 조제한 배지 (Table 2)에서 평판 배양하여(k) 호기성 및혐기성 세균은 37"C에서 1~2일, 효모와 곰팡이는 27℃에서 3~4일 배양한 후에 나타나는 colony의 균 수를 계수하였다(2).
- α-amylase의 활성도는 1% 전분 용액 2mL에 0.02 M 인산 완충액(pH 6.9) 1 mL를 넣어 기질로 사용하였고 미리 조제한 효소액을 1 mL 첨가하여 40℃에서 30분간 반응시킨 후, 1 M 초산 10mL로 반응을 정지시키고 N/3000 요오드 용액 10mL를 넣어 660nm에서 홉 광도를 측정한 후 효소액 1 mL가 나타내는 흡광도의 차(blank-시료)를 unit로 표시하였다.
- β-amylase 활성도의 경우 dinitrosalicylic acid 법(11)으로 측정하였으며 1% soluble starclr를 0.4 M 초산 완충액(pH 4.8)에 용해시켜 ImL 취한 것을 기질로 사용하였고 효소액 1 mL를 혼합한 후 30℃의 항온조에서 정확히 10분 간 반응시킨 후 di nitrosalicylic acid reagent 3 mL를 첨가하여 발색시켜서 660nm에서 흡광도를 측정하여, maltose로 표준곡선을 작성하여 효소액 1 mL가 maltose 1 mg을 유리시킬 때의 효소량을 1 unit로 하였다.
- 대조구(A)는 A. oryzae만을 찹쌀에 접종한 후 30℃ 에서 3일간 배양한 찹쌀 koji로 고추장을 제조하였다. 고초균 첨가구(B)는 B.
- 시료 10g에 증류수 200mL를 첨가하여밀봉하고 실온에서 4시간 진탕한 후 여과하여 효소액을 조제한 다음 효소활성을 측정하였다.
- oryzaeS. 접종한 찹쌀 koji를 혼합하여 고추장을 제조하였고. 효모 혼용구(C)는 A.
- 접종한 찹쌀 koji를 혼합하여 고추장을 제조하였고. 효모 혼용구(C)는 A. oryzae로 접종한 찹쌀 koji에 B. HchenifonnisS- 접종한 콩 koji를 혼합한후 S. muxii 배양액을 첨가하여 고추장을 제조하였다.
- 효소 활성은 amylase와 protease로 나누어 역가를 측정하였다(10). 시료 10g에 증류수 200mL를 첨가하여밀봉하고 실온에서 4시간 진탕한 후 여과하여 효소액을 조제한 다음 효소활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 사용된 균주는 세종대학교 식품공학과 생명공학연구실에 보관된 Aspergillus oryzae(OUT 5048)와 Saccha mmyces rouxii를 potato dextrose broth(PDB) 배지에계대 배양하여 최대 활성을 보일 때 종균으로 사용하였다. Bacillus licheniformis^- 재래식 고추장에서 Bacillus sp를 분리한 후 protease 활성이 높은 것을 선택하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(7)에 의해 동정하고, nutrient broth(NB) 배지에 계대배양하여 종균으로 사용하였다.
- 이와 같이 제조된 고추장은 20℃의 항온기에서 6개월간 숙성시키면서 매 1개월마다 담금한 항아리(중요무형문화재 제 96호, 이종각)에서 윗 부분을 걷어내고 약 15cm 깊이에서 시료를 채취하여 분석에 사용하였으며 매번 3회 반복하여 실시하였다.
- 찹쌀, 콩, 밀가루 및 고춧가루는 가락동 농수산물 시장에서 구입하였으며 소금은 식탁염(주식히사 한주, 순도 99%)을 사용하였다.
이론/모형
- rouxii를 potato dextrose broth(PDB) 배지에계대 배양하여 최대 활성을 보일 때 종균으로 사용하였다. Bacillus licheniformis^- 재래식 고추장에서 Bacillus sp를 분리한 후 protease 활성이 높은 것을 선택하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(7)에 의해 동정하고, nutrient broth(NB) 배지에 계대배양하여 종균으로 사용하였다.
성능/효과
- α-amylase와 β-amylase 활성도는 곰팡이와고초균을 혼합한 시험구가 비교적 높은 활성을 보여주었고 효모첨가구에서는 활성이 감소되었다. Acidic protease 활성도는 숙성 30일 이후 급격히 증가하는 경향이 나타났으며 특히 곰팡이와 고초균 혼용구에서 보다 높은 활성도를 보여주었다. 따라서 곰팡이 단 용구에 비해 고초균을 흔용 첨가한 고추장이 숙성 중 미생물 수도 많았고 효소 활성도가 높은 것으로 나타났다.
- 곰팡이 단용구에 비해 곰팡이와 고초균 혼용구에서 비교적 산 생성이 활발함을 알 수 있었다. pH의저하는 미생물의 성장, 특히 효모의 성장과 밀접한 관계를 보여주었다. 즉 pH가 5이하로 강하되면서 효모가 출현한 것을 관찰할 수 있었고, 특히 곰팡이는 pH가 강하되면서 크게 저해받는 것이 관찰되었다.
- 효모 첨가구에서는 30일 이후부터 효모 수가 증가하였으며 숙성 60일 이후부터는 감소하였다. α-amylase와 β-amylase 활성도는 곰팡이와고초균을 혼합한 시험구가 비교적 높은 활성을 보여주었고 효모첨가구에서는 활성이 감소되었다. Acidic protease 활성도는 숙성 30일 이후 급격히 증가하는 경향이 나타났으며 특히 곰팡이와 고초균 혼용구에서 보다 높은 활성도를 보여주었다.
- 고추장 숙성과정 중 호기성 세균의 변화는 Fig. 1과같이 고초균을 첨가한 B구와 C구는 담금 초기 3.9~4.2 x 106 생균 수였던 것이 숙성 30일 경에는 급속히 증가하였고 그후 서서히 감소하여 숙성 90일 이후에는 일정한 수준을 유지하는 경향을 보여주었으나, 곰팡이만을 첨가한 A구는 숙성 90일까지 완만하게 증가한 후 일정한 수준을 유지하였다. 특히 효모첨가구인 C구의 경우 숙성 90일 이후부터 호기성 세균의 수가 일정 수준을 유지하였으며, 이는 효모의 생육 시 세균의생육이 다소 저해가 있다는 이, 6의 보고와 유사하였다.
- 고추장숙성 중 acidic protease^] 활성도 변화는 Fig. 6과 같이 숙성 30일 이후부터 60일까지 급격히 증가하는 경향을 보여주었으며 특히 곰팡이와 고초균 혼용구에서보다 높은 활성도를 보여주었다. 고추장 숙성 후 acidic protease는 숙성 30일 경에 최대 값을 보였고(18) 신 등(17)도 단백질 분해효소 활성도.
- 고추장의 숙성기간 중 α-amylase 활성도의 변화는 Fig. 4와 같이 곰팡이와 고초균을 혼합한 B구가 다른 시험 구보다 비교적 높은 활성을 보여주었고, 숙성 30일까지 증가하는 경향이었으나, 그 후 급격히 감소하였다. 특히 효모 첨가구에서는 비교적 큰 폭으로 활성이 약해지는 것으로 보아 α-amylase 활성도가 곰팡이의 수와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 9로 숙성 30일까지 급격히 떨어지나, 그 후 완만히 감소하다가 90일 이후 약간 증가한다고 보고하여 본 실험과 비슷한 경향을 보였다. 곰팡이 단용구에 비해 곰팡이와 고초균 혼용구에서 비교적 산 생성이 활발함을 알 수 있었다. pH의저하는 미생물의 성장, 특히 효모의 성장과 밀접한 관계를 보여주었다.
- 2X106 생균 수였던 것이 숙성 30일 경까지 급속히 증가하였고 그후 서서히 감소되어 숙성 90일 이후에는 일정 수준을 유지하였다. 곰팡이 수는 숙성 30일까지 현저히 증가한 후 감소되어 숙성 60일이후에는 완만한 수준을 보였고, 고추장 숙성 기간 중효모 무첨가구에서는 고추장 숙성 30일경을 전후하여 효모를 발견할 수 있었으며 숙성 60일까지 급격히 증가한 후 감소하였다. 효모 첨가구에서는 30일 이후부터 효모 수가 증가하였으며 숙성 60일 이후부터는 감소하였다.
- Acidic protease 활성도는 숙성 30일 이후 급격히 증가하는 경향이 나타났으며 특히 곰팡이와 고초균 혼용구에서 보다 높은 활성도를 보여주었다. 따라서 곰팡이 단 용구에 비해 고초균을 흔용 첨가한 고추장이 숙성 중 미생물 수도 많았고 효소 활성도가 높은 것으로 나타났다.
- 이 결과는 이 등(12)의 보고와는 유사하였으나, 90일 이후에는 곰팡이가 거의 검출되지 않는다는 보고(14)와는 상이하였다. 본 연구 결과 60일 이후에는 곰팡이가 비교적 숙성에 관여하지 않는 것으로 생각되므로 지속적으로 숙성에 관여하는 고초균이 고추장 발효에 비교적 바람직한 종국으로 사료된다. 시험구 별로 관찰한 결과 효모 첨가구에서 곰팡이 수가 두드러지게 감소하였는데 이 결과는 세균에 비해 곰팡이의 생육이 효모의 생육과 밀접한 관계가 있는 것을 나타낸다.
- 본 연구 결과 60일 이후에는 곰팡이가 비교적 숙성에 관여하지 않는 것으로 생각되므로 지속적으로 숙성에 관여하는 고초균이 고추장 발효에 비교적 바람직한 종국으로 사료된다. 시험구 별로 관찰한 결과 효모 첨가구에서 곰팡이 수가 두드러지게 감소하였는데 이 결과는 세균에 비해 곰팡이의 생육이 효모의 생육과 밀접한 관계가 있는 것을 나타낸다.
- pH의저하는 미생물의 성장, 특히 효모의 성장과 밀접한 관계를 보여주었다. 즉 pH가 5이하로 강하되면서 효모가 출현한 것을 관찰할 수 있었고, 특히 곰팡이는 pH가 강하되면서 크게 저해받는 것이 관찰되었다.
- 4와 같이 곰팡이와 고초균을 혼합한 B구가 다른 시험 구보다 비교적 높은 활성을 보여주었고, 숙성 30일까지 증가하는 경향이었으나, 그 후 급격히 감소하였다. 특히 효모 첨가구에서는 비교적 큰 폭으로 활성이 약해지는 것으로 보아 α-amylase 활성도가 곰팡이의 수와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 이(6)는 효모를 첨가한 개량식 고추장의 경우 α-amylase는 담금 10 일 이후 감소하다가 50일 경에 다시 상승한 후 감소하였다고 보고하여 본 실험 결과와 비슷한 경향을 보였다.
- 한편 고추장 숙성 중 전분질을 분해하여 환원성 당을 생성시키는 당화효소인 β-amylase 활성도의 변화는 Fig. 5와 같이 숙성 30일 경까지 급격한 증가를 보였으나 그 이후에는 계속적으로 감소하였으며 α-amylase 의 경우에서와 같이 곰팡이와 고초균의 흔용구에서 β-amylase의 활성도가 높았다. 신 등(17)은 고추장의 전분 액화 효소와 당화효소의 활성이 엿기름 첨가시 급격히 증가하였고 고추장 숙성 40일 경까지는 감소하다가 60 일 경에 다시 증가하여 90일 경에는 감소하였고 또한 고추 품종을 달리 하였을 때 0-amylase의 활성이 고추장 숙성 60일에 가장 높았으며 그 이후 급격히 감소하였다고 보고하여(18) 본 실험 결과와 상이하였다.
- 과 같이 효모 첨가구에서는 숙성 60일까지 급격히 증가한후 감소하는 경향을 보여주었다. 효모 무첨가구에서는 고추장 숙성 30일경을 전후하여 효모를 발견할 수 있었으며 숙성 60일 이후부터 숙성 90일까지 급격히 증가한 후 지속적으로 감소하는 경향을 보여주었으나 그수는 효모첨가구에 비해 적었다. 효모는 고추장 향미성분 및 저장성과 밀접한 관련이 있는 에탄올 생산에 관여하므로 이(6)는 고추장 제조시 효모의 수가 많은것이 유용하므로 고추장을 담글 때 효모의 첨가가 바람직하다고 하였다.
후속연구
- 고추장의 식염농도는 약 10~15%이므로 Saccham myces muxii가 바람직한 것으로 생각된다. 따라서 밀가루나 찹쌀만으로 제국을 하여 사용하는 것보다는 더욱 강력한 당화 효소를 분해하는 Aspergillus oryzae를 전분질 원료에 제국하여 사용하고, Bacillus lichenijbrmis는 콩에 제국한 다음 이를 혼합하면 amylase 활성과 protease 활성이 각각 우수한 혼합 koji를 얻을 수 있을 것이다. 또한 전통고추장에서 분리하여 동정한 풍미가 우수한 효모인 Sacchammyces rouxii를 첨가하면 고추장 제조시 숙성이 단축될 것으로 생각된다.
- 따라서 밀가루나 찹쌀만으로 제국을 하여 사용하는 것보다는 더욱 강력한 당화 효소를 분해하는 Aspergillus oryzae를 전분질 원료에 제국하여 사용하고, Bacillus lichenijbrmis는 콩에 제국한 다음 이를 혼합하면 amylase 활성과 protease 활성이 각각 우수한 혼합 koji를 얻을 수 있을 것이다. 또한 전통고추장에서 분리하여 동정한 풍미가 우수한 효모인 Sacchammyces rouxii를 첨가하면 고추장 제조시 숙성이 단축될 것으로 생각된다.
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