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문제 정의
- 콩은 우유, 계란과 더불어 우리나라에서 과민성 알레르기를 일으키는 대표적인 식품중의 하나로 손꼽힌다. 이에 본 연구에서는 콩에 알레르기 반응을 일으키는 환아의 혈청과 콩 단백질을 토끼에 면역하여 얻은 다클론 항체를 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 방법을 통하여 가열 처리한 콩과의 반웅성을 조사 함으로서 가열처리가 콩의 항원성 내지는 알레르기성에 미치는 영향을 조사하였다. 물중탕으로 1 시간까지 가열 처리 후 SDS-PAGE에 의해 분리된 콩 단백질은 열처리에 따른 콩 단백질 band의 변화를 관찰할 수 없었다.
제안 방법
- 이에 본 연구에서는 콩을 가열 처리한 후 콩 단백질을 분리하여 콩에 대해 알레르기 반응을 일으키는 환자들의 혈청과 콩 단백질을 토끼에 면역시켜 얻은 다클론항체 (polyclonal antibody)를 이용하여 immunoblotting과 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)의 방법을 통해 가열 처리에 따른 콩의 알레르기성 변화를 연구하였다.
- 대두 단백질에 대한 특이항체의 생산을 위해 분리 정제된 콩 단백질을 PBS(0.25M NajHPQ, 0.25M Nal^PQp 0.75 M NaCl, pH 7.2)에 용해하여 2마리의 토끼(New Zealand White)에 면역하였다. 이때 콩 단백 질의 일희 면역원량은 500㎍이었으며 PBS에 용해시 켜 Freund's complete adjuvant와 혼합하여 피호 주사하였다.
- Hexane 처리하여 얻어진 탈지 대두분말 0,5 g씩을 증류수로 20배(w/w) 회석하고 UXTC 끓는 물에서 각각 0분, 2분, 5분, 10분, 30분, 60분 중탕 가열 처리하였다. 또한 본 시료 중 일부분은 전자레인지에서 2분간 가열 처리하였다.
- 분리된 단백질 농도는 Bio-Rad에서 제공된 Protein Assay Kit(Cat. No. 500-001)를 이용하여 측정하였고 이때 bovine serum albumin(BSA)를 표준물질로 사용 하였다.
- 03% Tween20이 포함된 PBS 용액으로 3회 세척 후 1: 3000 으로 희석한 streptavidine alkaline phosphatase와 30분 간 반응시켰으며 3회 세척하였다. 이후 alkaline phosphatase conjugate substrate를 반응시켜 발색 반웅 을 관찰하였다.
이론/모형
- 3%의 Tween20이 포함된 PBS로 1시간 실온에서 blocking하 였다. Immunoblottiiig은 손, Scheurer둥의 방법에 따라 실행되었다,(9,10). Polyclonal antibody는 1: 2000으로 희 석하여 16시간 반응시키고 0.
성능/효과
- 이상의 결과로 부터 콩 알레르겐의 항원성 및 알레르기성은 가열처리에 의해 변화되지 않음을 확인할 수 있었다.
- 5분 이상 가열 처리된 대두 단백질에서는 대략 15kDa 크기의 단백질 밴드가 희미해지는 것이 관찰되었으나 열처리 되지 않은 대두와 2분 가열 처리한 대두 단백질과의 차이는 미약하였다. 또한 열처리 하지 않은 soy total과 5분간 열을 가한 whey fraction, globulin fraction 단백질을 비교한 결과 뚜렷한 차이는 보이지 않았으며, soy total 과 whey fraction, 이obulin firaction에서 약간씩 다른 단백질 band를 관찰할 수 있었다. 그리고 whey fraction 과 globulin firaction에서는 강하게 염색된 단백질 batid 가 서로 다른 위치에 있음을 확인할 수 있었다.
- 그리고 whey fraction 과 globulin firaction에서는 강하게 염색된 단백질 batid 가 서로 다른 위치에 있음을 확인할 수 있었다. Whey fraction에서는 대략 40kDa 크기의 단백질이, globulin fraction에서는 40kDa 크기 단백질 외에 80-85 kDa 사이의 두 단백질 밴드가 또렷하게 관찰되었으며 그 밖에 50, 45, 22 kDa 크기의 단백질 band롤 비교적 또렷하게 확인할 수 있었다.
- Soy toted과 whey fraction^ 단백질을 토끼에서 얻어진 다클론 항체와의 반옹을 immunobotting한 결과 서로 비슷한 위치에서 band가 관찰됨을 확인할 수 있었 다 (Fig. 2). SDS-R\GE 분리 후 Cooiliassie로 염색한 gel에서 진하게 나타났던 대략 40kDa 크기의 대두 단 백질은 다클론 항체에 의해 인식되지 않았으며 Globulin 의 경우에서도 열처리에 관계없이 비슷한 Sand 모양이 확인되었다.
- 2). SDS-R\GE 분리 후 Cooiliassie로 염색한 gel에서 진하게 나타났던 대략 40kDa 크기의 대두 단 백질은 다클론 항체에 의해 인식되지 않았으며 Globulin 의 경우에서도 열처리에 관계없이 비슷한 Sand 모양이 확인되었다. 다클론 항체에 의해 강하게 인식된 대두 단백질은 크기가 대략 26 kDa정도의 단백질이었으 며, 48kDa 정도의 단백질도 또렷하게 확인되었다.
- SDS-R\GE 분리 후 Cooiliassie로 염색한 gel에서 진하게 나타났던 대략 40kDa 크기의 대두 단 백질은 다클론 항체에 의해 인식되지 않았으며 Globulin 의 경우에서도 열처리에 관계없이 비슷한 Sand 모양이 확인되었다. 다클론 항체에 의해 강하게 인식된 대두 단백질은 크기가 대략 26 kDa정도의 단백질이었으 며, 48kDa 정도의 단백질도 또렷하게 확인되었다. Coomassie로 염색한 gel상에서는 5분 이상의 열처리된 대두 단백질에서 18 kDa크기의 단백질 밴드가 다소 감소되는 경향을 보인 반면 immunoblotting 검사에서는 오히려 5분 이상의 열처리된 대두 단백질에서 18 kDa 크기의 단백질 밴드가 다클론 항체에 의해 약하게 인 식되었다.
- 대두에 대해 알레르기 반응을 일으키는 9명의 대두 알레르기 환자 혈청을 1명의 정상인의 혈청과 함께 ELISA법을 이용하여 각기 다른 시간 열처리 하고 분리한 콩의 globulin 단백질과의 반응 정도를 조사한 결과 대부분의 환자 혈청에서는 immunoblotting에서의 결과와 같이 열처리한 시간에 관계없이 환자의 특이 항체 IgE는 콩 알레르겐과 대등한 반응성을 나타냈다.(Fig.
- 3). 그러나 ELISA법에 의해 조사된 총 9명의 대 두 알레르기 환자 혈청 중에서 두 명의 혈청(환자 8와 9)은 immunoblotting에서는 구별되지 않았던 반응성의 차이를 확인할 수 있었는데 이들 두 환자의 혈청은 가열하지 않은 대두 단백질에 대해 가열 처리한 것보다 대략 1.5-2배 더 강력한 반응을 나타냈다. 또한 대부분의 환자 특이 항체는 다클론 항체보다 약하게 대두 단백질과 반응한 반면, 두 환자(혈청 10과 11)의 혈청에서는 다클론 항체와 대등한 강력한 반응을 나타냈다.
- 본 연구에서 조사된 콩 단백질의 전기영동 분리 결과를 보면 콩 단백질은 열처리에 따른 단백질 분해 정도가 크지 않았으며, immunoblotting과 ELISA의 결과 자료를 분석해 볼 때 그 항원성의 변화에도 큰 영향이 없음이 확인되었다. 이는 이미 연구된 땅콩, 새우, 우유 및 어류에서의 연구 결과⑺와 잘 일치하였다.
- 이는 이미 연구된 땅콩, 새우, 우유 및 어류에서의 연구 결과⑺와 잘 일치하였다. 본 실험의 immunoblotting과 ELISA 결과를 종합해 볼 때 콩에 존재하는 알레르겐 단백질은 열처리를 통해서도 대부분의 환자에 있어서 환자 혈청내의 IgE가 인식하는 부위(epitope)가 보존되었으며 대두 알레르겐은 사과의 주요 알레르겐인 Mai d I(9)의 경우와는 달리 단백질의 공간적 3차원 구조와는 무관한 sequential epitope를 갖고 있다고 추측된다. 그러나 ELISA의 결과에서 나타났듯이 환자마다 알레르겐과의 반응 정도의 차이와 일부 소수의 환자는 열처리에 따른 대두 단백질과의 반응성이 약화되는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 실험의 immunoblotting과 ELISA 결과를 종합해 볼 때 콩에 존재하는 알레르겐 단백질은 열처리를 통해서도 대부분의 환자에 있어서 환자 혈청내의 IgE가 인식하는 부위(epitope)가 보존되었으며 대두 알레르겐은 사과의 주요 알레르겐인 Mai d I(9)의 경우와는 달리 단백질의 공간적 3차원 구조와는 무관한 sequential epitope를 갖고 있다고 추측된다. 그러나 ELISA의 결과에서 나타났듯이 환자마다 알레르겐과의 반응 정도의 차이와 일부 소수의 환자는 열처리에 따른 대두 단백질과의 반응성이 약화되는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 알레르기 연구에 있어서 모든 환자들이 알레르겐에 동일하게 반웅을 일으키지 않는다는 점을 항상 고려해야 한다는 중요한 자료를 재시하는 결과이다.
- 또한 대부분의 환자 특이 항체는 다클론 항체보다 약하게 대두 단백질과 반응한 반면, 두 환자(혈청 10과 11)의 혈청에서는 다클론 항체와 대등한 강력한 반응을 나타냈다. ELISA법을 이용한 다클론항체의 가열 처리한 대두 단백질에 대한 반응성은 immunoblotting에서의 결과와 마찬가지로 가열처리의 시간과는 무관하게 일정하고 높은 반웅성을 유지하였다.
후속연구
- 본 연구는 앞으로의 콩 알레르겐 epitope 연구의 방향을 제시한 중요한 결과로써, 앞으로 합성 펩타이드와 protease를 이용해 생성된 콩 알레르겐 단백질의 단편 조각들의 환자 혈청과의 반웅성 검사로서 대다수의 환자들에게서 확인된 대두 단백질의 sequential epitope의 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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