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제안 방법
- 5% Skim milk가 포함된 TBST로 1:100으로 희석하여 실온에서 2시간 반응시키고 TBST 용액으로 3회 세척 후, 1:1000으로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-human IgE와 실온에서 1시간 반응시켰다. TBST 용액으로 3회 세척 후, ECL (enhanced chemiluminescense, Amersham Pharmacia Biotech, Buck-inghamshire, UK)를 이용하여 X-ray 필름(Eastman Kodak, Rochester, N.Y., USA)에 감광시켜 발색반응을 관찰하였다.
- 05%(v/v) tween 20) 용액으로 4℃에서 하룻밤 blocking 하였다. TBST 용액으로 3회 세척 후, 환아 혈청은 2.5% Skim milk가 포함된 TBST로 1:100으로 희석하여 실온에서 2시간 반응시키고 TBST 용액으로 3회 세척 후, 1:1000으로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-human IgE와 실온에서 1시간 반응시켰다. TBST 용액으로 3회 세척 후, ECL (enhanced chemiluminescense, Amersham Pharmacia Biotech, Buck-inghamshire, UK)를 이용하여 X-ray 필름(Eastman Kodak, Rochester, N.
- 세 가지 품종의 콩의 열처리 방법에 따른 항원성의 변화를 확인하기 위해 볶는 공정은 130-140℃로 가열된 frying pan에서 7분 실행하였으며, 발효 공정은 콩을 콩 무게의 2.2배가 될 때까지 수침하여 1시간 물빼기 한 후 121℃, 25분 가압 증자하여 충분히 냉각 시키고 Bacillus subtilis GSK 3580을 106 CFU/g 농도로 접종하여 37℃, 24 시간 발효시켰다.
- 열처리하지 않은 콩과 열처리한 콩을 곱게 분쇄하고 시료 내 존재하는 지방성분을 제거하기 위하여 5배의 n-Hexan을 넣고 실온에서 1시간 동안 교반시키는 과정을 두 번 반복하였다. 이렇게 하여 얻은 분말은 30 mM Tris-HCl (pH8.
- 이에 본 연구에서는 다양한 콩 가공식품의 제조 시 사용되는 열처리 방법에 따라 세 가지 품종의 콩 단백질을 추출하여 구성단백의 변화를 살펴보고, 콩 특이 IgE 항체 수치가 높은 환아 혈청들을 사용하여 immunoblotting과 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)의 방법을 통해 열처리 방법에 따른 품종별 콩 알레르기성 변화를 비교, 분석하였다.
- 8, 50% glycerol, 10% SDS, 2-mercaptoethanol, 1% bromphenol blue)와 2:1 (w/v)로 섞은 후 끓는 물에서 5분간 가열한 뒤 lane 당 3 μg/ml로 분리하였다. 전기 영동은 100 volt에서 90분 시행하였으며 전기영동 후, gel은 Coomassie staining solution (1.0 g Coomassie Blue R-250, 450 ml methanol, 450ml H2O, 100 ml glacial acetic acid, 800 ml H2O)로 20분간 염색하고 Coomassie destaining solution (100 ml methanol, 100 ml glacial acetic acid, 800 ml H2O)로 적절히 탈색 후 구성단백들의 분포를 비교분석 하였다.
- 품종별로 열처리하지 않은 생콩, 볶은 콩, 증숙하여 발효시킨 콩의 추출물을 항원으로 사용하였고, 각각의 추출물을 96-well plate (NUNC, Denmark)에 최종 농도가 10 μg/ml 이 되도록 PBS (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 희석하여 각 100 μl씩 분주하고 4℃에서 하룻밤 coating하였다.
대상 데이터
- 2010 년 3월부터 2010 년 8월까지 삼성서울병원 소아과에 내원하여 Hanifin의 진단기준[11]에 따라 혈청 내 콩에 대한 특이 IgE 수치가 30 kU/l 이상을 보인 환아 7명을 대상으로 하였다(Table 1). 이 중 실제로 대두에 대한 알레르기 증상을 보인 경우는 4명이었고, 나머지는 이전에 대두를 먹은 경험이 없는 환아였다.
- 본 실험에 사용된 콩은 국립 식량과학원으로부터 제공 받았으며, 장류 제조용으로 적합한 품종으로 국내에서 가장 많이 유통되고 있는 대풍, 대원, 태광 품종을 시료로 사용하였다. 발효 공정에서 사용한 균주는 경상대학교 생물공학실험실에서 분리한 Bacillus subtilis GSK 3580을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 콩은 국립 식량과학원으로부터 제공 받았으며, 장류 제조용으로 적합한 품종으로 국내에서 가장 많이 유통되고 있는 대풍, 대원, 태광 품종을 시료로 사용하였다. 발효 공정에서 사용한 균주는 경상대학교 생물공학실험실에서 분리한 Bacillus subtilis GSK 3580을 사용하였다.
- 이 중 실제로 대두에 대한 알레르기 증상을 보인 경우는 4명이었고, 나머지는 이전에 대두를 먹은 경험이 없는 환아였다. 혈청 내 콩 특이 IgE는 CAP-FEIA (Pharmacia, Uppsala, Sweden)으로 측정하였고, 정상 대조군은 콩 특이 IgE가 없으면서 콩 섭취 후 어떠한 증상도 발현되지 않는 건강한 성인으로 하였으며, 혈청은 -80℃에 보관하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 3회 이상 실험을 반복하여 얻은 자료를 이용하여 평균±표준편차로 나타내었고, 유의성 검증을 위하여 SPSS 12.0 for window를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며 control과의 유의한 차이를 검증하기 위하여 Tukey’s 사후검정을 실시하였다(p<0.05).
이론/모형
- ELISA는 Engvall와 Perlmann등의 방법에 준하여 실시하였다[9]. 품종별로 열처리하지 않은 생콩, 볶은 콩, 증숙하여 발효시킨 콩의 추출물을 항원으로 사용하였고, 각각의 추출물을 96-well plate (NUNC, Denmark)에 최종 농도가 10 μg/ml 이 되도록 PBS (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 2.
- Immunoblotting은 Son, Scheurer 등의 방법에 준하여 실시하였다[25,29]. SDS-PAGE 후 분리된 단백질은 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad, USA)에 trasnsfer buffer (tris base 11.
- 열처리 방법에 따른 품종별 콩 알레르겐 함량의 변화를 추정하기 위하여 Laemmli의 방법[7,17]에 준하여 SDS-PAGE를 실시하였다. Gel은 12% separating gel과 5% stacking gel을 이용하였고, 시료는 3배 농도의 sample buffer (1 M Tris-HCl: pH 6.
- 이 용액을 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상징액을 사용 전까지-20℃에서 보관하였다. 추출된 단백질은 Bradford method [5]에 근거한 Bio-Rad의 Protein Assay [3]로 정량하였고, 표준물질로 BSA (bovine serum albumin)을 사용하였다.
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