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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 아플라톡신 생성균의 생육을 억제시킬 수 있는 길항 미생물(Bacillus sp.)을 분리하고 그 미생물을 이용한 된장 제조시 된장에서의 아플라톡신 제어 효과 및 된장의 품질에 미치는 영향을 검토하였다.
- 본 연구는 아플라톡신 생성균의 생육을 억제시킬 수 있는 길항 미생물을 분리하고 그 길항 미생물을 이용한 된장 제조시 아플라톡신 제어 효과와 된장의 품질에 미치는 영향을 조사하였다. 아플라톡신 생성균인 Asp.
제안 방법
- PDA 평판배지 중앙에 아플라톡신 생성균을 접종하고 25℃에서 24시간 배양한 후 그 주변에 분리한 균주를 양쪽에 접종하여 25℃에서 7일간 배양하면서 가장 큰 저지대(inhibition zone)를 형성하는 균주를 아플라톡신 생성균에 대한 길항력이 우수한 길항미생물로 선발하였다. 분리된 길항미생물의 특성은 Bergey's mannual of systematic bacteriology(11), Microbiological method(12), The Procaryotes(13) 등의 방법에 의하여 미생물의 형태적 성질 및 생리 생화학적 성질 등을 검토하였다.
- flavus과 Asp. parasiticus 포자 현탁액 각 10 mL, 길항균 배양액 10mL씩, 길항균 배양액 (NB 배지, 24시간) 10 mL+아플라톡신 생성 균 포자현탁액 10mL씩을 혼합하여 제조하였으며 초기에 약간 건조한 후 90일 동안 30℃ 내외의 자연상태에서 발효시켜 메주를 완성하였다. 된장은 재래식으로 메주 10 ㎏을 23% 염수(NaCl) 2 L에 넣고 상온에서 40일간 방치한 다음 수분염수)을 제거하고 상온에서 90일 동안 숙성하여 제조하였다.
- flavus나 Asp. parasiticus, 또는 길항균 (antifiingal bacteria #19, Bacillus sp.)을 첨가한 메주로 된장을 제조하고 그 특성을 조사하였다. 길항균을 첨가한 된장의 아플라톡신 및 일반성분에 대한 결과는 Table 2와 같다.
- parasiticus 포자 현탁액 각 10 mL, 길항균 배양액 10mL씩, 길항균 배양액 (NB 배지, 24시간) 10 mL+아플라톡신 생성 균 포자현탁액 10mL씩을 혼합하여 제조하였으며 초기에 약간 건조한 후 90일 동안 30℃ 내외의 자연상태에서 발효시켜 메주를 완성하였다. 된장은 재래식으로 메주 10 ㎏을 23% 염수(NaCl) 2 L에 넣고 상온에서 40일간 방치한 다음 수분염수)을 제거하고 상온에서 90일 동안 숙성하여 제조하였다.
- 된장의 휘발성 향기성분 추출은 연속 증류 추출장치 (Likens and Nikerson type simultaneous steam distillation and extraction apparatus, SDE)로 상압에서 2시간 동안 추출하였다. 이때 휘발성 성분의 추출용매는 n-pentan과 diethylether 혼합용매(1 : 1) 200 mL를 사용하였다.
- 미생물의 편모염색 및 운동성은 Gray법과 현적슬라이드법으로 하였다. 미생물의 포자는 malachite green으로 염색하여 내생포자형성 유무와 포자위치를 현미경을 이용하여 관찰하였다. 생리적 특성으로 gelatin 가수분해, starch hydrolysis, arginin dihydrolase, 탄소원 자화성 등을 조사하였다.
- 미생물의 포자는 malachite green으로 염색하여 내생포자형성 유무와 포자위치를 현미경을 이용하여 관찰하였다. 생리적 특성으로 gelatin 가수분해, starch hydrolysis, arginin dihydrolase, 탄소원 자화성 등을 조사하였다.
- 아플라톡신 분석은 된장 25 g에 NaCl 5 g, 60% 메탄올 125 mL를 가하고 브랜더로 5분간 추출하여 i㎜unoaffinity 칼럼에 분당 2~3mL씩 통과시켜 흡착시킨 후 10mL 물로 2회 수세 후 메탄올 1 mL로 아플라톡신을 용출하였다.
- 아플라톡신 추출 액은 안전 농축 후 trifluoroacetate 0.1 mL를 가하며 유도체화한 다음 HPLC(Waters)로 분석하였다. HPLC 분석조건은 column으로 Prodigy 5 µ ODS-2(150×4.
- 여과 잔사에 80% 에탄올을 60mL씩 가하고 1 시간씩 6회 추출한 다음 다시 여과하여 여액을 모아 감압 농축하고 에탄올을 증발시킨 후 중류수에 녹여 50mL되게 만들고, Sep pak C18로 처리한 다음 여액 20µL를 HPLC에 주입하여 분석하였다. 분석시 columne Prodigy 5g ODS-2( 150×4.
- 용출액을 건조시키고 구연산 완충액(pH 2.2)에 녹여 아미노산 자동분석기(Waters)로 분석하였다. Columne 3.
- 가하여 20mL로 정용하였다. 이것을 원심분리하여 0.45 ㎛ membrane filterS- 여과하고 Sep-pak C18로 색소 및 단백질 성분을 제거 한 후 그 여액을 HPLC (Waters 사)에 주입하여 분석하였으며, 그 조건은 µ-Bondapak C18(3.9×30㎝) column으로 0.5% KH2PO4 용매를 이용하여 1.0mL/min 유속으로, 검출기는 UV 214 ㎚로 하였다.
- 이때 휘발성 성분의 추출용매는 n-pentan과 diethylether 혼합용매(1 : 1) 200 mL를 사용하였다. 추출 후 추출용매는 무수 Na2SO4를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 방치하여 수분을 제거하고 농축하여 GCC/MSD(HP사, 모델 6890)로 분석하였다. GC 칼럼은 HP-5MS(crosslinked 5%HP ME Siloxane)을, 유속은 헬륨을 1.
대상 데이터
- 5) 100 mW] 넣고 10분간 진탕 한 후 영양한천배지[nutrient agar(NA) plate]에 농도별로 희석하여 도말하고 30℃에서 24~36시간 배양한 후 균주를 분리하였다. 분리된 미생물은 아플라톡신 생성균에 대한 길항력 실험에 사용하였다.
- 시험용액은 GC(HP사, 모델 6890)을 이용하여 분석하였는데 column으로는 DB wax capillary column을, 검출기는 FID를 사용하였다. 주입구 온도는 230℃로 하고 oven 온도는 165℃에서 1분간 유지시킨 후 200℃까지 분당 2P씩 승온시켜 분석하였으며 carrier gas는 질소로 분당 2 mL씩 흘렸다.
- 아플라톡신 생산균에 대한 길항 미생물을 찾기 위하여 대두, 벼, 보리 등 각종 곡류에서 500여종의 단일 균주를 분리하고 길항력 시험결과 가장 길항력이 큰 antifungal bacteria #19 균주를 선발하였다. 선발된 antifungal bacteria #19 균주에 대하여 아플라톡신 생성균에 대한 길항력을 검토한 결과는 Fig.
- 아플라톡신 생산균으로는 한국종균협회로부터 분양받은 Aspergillus flavus(KCCM 35078)과 Aspergillus parasiticus(KCCM 35075)를 사용하였다.
이론/모형
- 각종 곡류에서 희석평판법을 이용하여 단일 균주를 분리하였다. 채취한 시료를 tris-HCl buffer solution(pH 7.
- 분리된 길항미생물의 특성은 Bergey's mannual of systematic bacteriology(11), Microbiological method(12), The Procaryotes(13) 등의 방법에 의하여 미생물의 형태적 성질 및 생리 생화학적 성질 등을 검토하였다. 미생물의 편모염색 및 운동성은 Gray법과 현적슬라이드법으로 하였다. 미생물의 포자는 malachite green으로 염색하여 내생포자형성 유무와 포자위치를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 분리된 길항미생물의 특성은 Bergey's mannual of systematic bacteriology(11), Microbiological method(12), The Procaryotes(13) 등의 방법에 의하여 미생물의 형태적 성질 및 생리 생화학적 성질 등을 검토하였다. 미생물의 편모염색 및 운동성은 Gray법과 현적슬라이드법으로 하였다.
- 9mL/min으로 하였다(14). 한편, 수분은 105℃ 건조방법으로, 식염은 Mohr법으로 정량하였다(14).
성능/효과
- flavus와 Asp. parasiticus는 모두 antifungal bacteria #19 균주에 의해 생육 저지되었으며 2% benzoic acid보다도 저지효과가 훨씬 좋았다. 따라서 본 연구에서 분리한 길항미생물은 Asp.
- 5% 억제되었으며, Asp. parasiticus를 길항균을 처리한 된장도 아플라톡신 B1이 3.7 ppb로서 길항균 처리결과, 아플라톡신 생성이 87.8% 억제되었다. 따라서 본 연구에서 분리한 길항균은 아플라톡신생성을 평균 88% 정도 억제시킬 수 있었다.
- 1 ㎎%가 낮았는데, Asp. parasiticus를 처리한 된장에서 가장 많이 감소되는 경향을 보였다. Glutamic acid, aspartic acid, tryptophan등이 모두 감소하는 현상을 보였다.
- flavus와 Asp. parasiticus에 대해 길항력이 가장 강력한 균을 분리하였으며 그 균은 Bacillus 속의 특성을 보였다. 분리한 길항균과 아플라톡신 생성균을 처리하여 제조한 된장의 아플라톡신 함량은 Asp.
- Asp. y/avus와 길항균으로 처리한 된장은 아플라톡신 B1이 3.4 ppb로서 길항균 처리결과, 아플라톡신 생성이 87.5% 억제되었으며, Asp. parasiticus를 길항균을 처리한 된장도 아플라톡신 B1이 3.
- 따라서 본 연구에서 분리한 길항균은 아플라톡신생성을 평균 88% 정도 억제시킬 수 있었다. 그리고 길항균과 아플라톡신 생성균을 함께 처리한 된장의 아플라톡신 수준은 우리나라 허용기준인 10 ppb 이하였다.
- 시료 된장의 유리 아미노산 함량을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 대조구 된장의 유리아미노산은 glutamic acid가 316.1 ㎎%, aspartic acid가 224.3 ㎎%, tryptophan가 184.2 ㎎%, leucine 이 132.3 ㎎%의 순으로 많았으며 총 1678.7 ㎎%였다.
- 함량은 Table 5와 같다. 된장의 유기산 함량은 oxalic acid 104.6 ㎎으로 가장 많았고 그 다옴으로 malic acid, citric acid, lactic acid, acetic acid 순이었다. 양 등(20)은 재래식 된장에서 산기를 나타내는 유기산으로는 oxalic acid, succinic acid, fumarate, citric acid 순으로 많이 함유하고 있다고 보고하였으며 정 등(21)은 시판중인 재래식 된장에서 유기산은 oxalic acid가 130.
- 2에 나타낸 시료 된장(대조구)의 GC-MS 크로마토그램으로부터 mas spectrum과 retention time을 비교 분석하여 휘발성 화합물을 동정한 결과는 Table 7 과 같다. 된장의 휘발성 향기성분은 총 47종 동정되었으며 주된 화합물로는 1-octen-3-ol, 2-methyl butanol, 9, 12-octadecadienal, hexadecanoic acid, isobuthyl isopentanoic acid ester, 2-pentylfuran, 3-octanone, benzaldehyde, methyl benzene등의 함량이 높게 나타났다.
- 8% 억제되었다. 따라서 본 연구에서 분리한 길항균은 아플라톡신생성을 평균 88% 정도 억제시킬 수 있었다. 그리고 길항균과 아플라톡신 생성균을 함께 처리한 된장의 아플라톡신 수준은 우리나라 허용기준인 10 ppb 이하였다.
- 생성되지 않았다. 또한 불쾌취로 알려진 butanoic acid류는 길항균 처리로 없어지거나 감소하였는데 2-methyl butanoic acid methyl ester는 없어졌으며, 2-methyl butanoic acid ethyl ester와 3-methyl butanoic acid ethyl ester는 감소하였다. 된장 향기 성분에서 중요한 역할을 할 alkane류인 octadecane 화합물은 길항균 처리로 오히려 중가하였는뎨 대조구에서는 3.
- 아플라톡신 생성균이 처리된 된장의 향기성분은 대조구와 큰 차이 없었으며 아플라톡신 생성균은 된장의 향기 성분에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나 길항균 Bacillus sp을 처리한 된장의 향기성분은 대조구와 약간의 차이를 보였다.
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