[논문]전통 발효 된장으로부터 분리된 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대한 유산균의 항균 활성

임은서

doi:10.7845/kjm.2018.8058

전통 발효 된장으로부터 분리된 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대한 유산균의 항균 활성
Antibacterial activity of lactic acid bacteria against biogenic amine-producing Bacillus spp. isolated from traditional fermented soybean paste 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.54 no.4, 2018년, pp.398 - 409

초록
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본 연구에서는 된장으로부터 바이오제닉 아민 생성 바실러스균과 박테리오신 생산유산균은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정하였고, 이들 균주들의 혼합 배양으로 제조한 청국장의 이화학적 및 미생물학적 특성을 조사하였다. 총10종의 시료로부터 바이오제닉 아민을 생성하는 바실러스균은 Bacillus licheniformis DB102, B. subtilis DB203, B. stearothermophilus DB206, B. pumilus DB209, B. subtilis DB310, B. coagulans DB311, B. cereus DB313, B. amyloliquefaciens DB714, B. amyloliquefaciens DB915, B. licheniformis DB917, B. cereus DB1019, B. subtilis DB1020, B. megaterium DB1022로 동정되었다. 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대해 항균 활성을 나타낸 박테리오신 생산균은 Lactobacillus plantarum DLA 205, L. brevis DLA501, L. fermentum DLA509, L. acidophilus DLA703 및 Enterococcus faecalis DLA804로 확인되었다. 유산균의 박테리오신은 농도의존적으로 바이오제닉 아민 생성균의 생균수 및 아민 생성능을 유의하게 감소시켰다. 따라서 유해 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타낸 유산균의 증식에 따라 유산균과 바실러스균을 혼합 배양하여 제조한 청국장의 pH, 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량은 대조구에 비해 유의하게 감소되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the present study, biogenic amine-forming Bacillus spp. and bacteriocin-producing lactic acid bacteria (LAB) isolated from Doenjang were generally identified through 16S rRNA gene sequencing, and the physicochemical and microbiological characteristics of cheonggukjang prepared using the isolated strains were investigated. Biogenic amine-producing bacteria from the samples were identified as Bacillus licheniformis DB102, B. subtilis DB203, B. stearothermophilus DB206, B. pumilus DB209, B. subtilis DB310, B. coagulans DB311, B. cereus DB313, B. amyloliquefaciens DB714, B. amylolique-faciens DB915, B. licheniformis DB917, B. cereus DB1019, B. subtilis DB1020, B. megaterium DB1022. The bacteriocin-producing LAB showed antibacterial effect against biogenic amine-producing Bacillus spp. were identified as Lactobacillus plantarum DLA205, L. brevis DLA501, L. fermentum DLA509, L. acidophilus DLA703, and Enterococcus faecalis DLA804. The bacteriocin produced by the LAB significantly decreased the viable numbers and the amine production ability of the biogenic amine-forming Bacillus spp. in a concentration dependent manner. Therefore, the pH, ammonia nitrogen and biogenic amine content of cheonggukjang prepared by mixed culture of the LAB and Bacillus spp. were significantly decreased compared to the control group.

주제어

표/그림 (3)

표 Table 1. Screening and identification of biogenic amine producing-Bacillus spp. isolated from traditional Korean fermented Doenjang
표 Table 2. Identification and antibacterial activity of bacteriocin-producing LAB against biogenic amine-forming Bacillus spp.
표 Table 3. Changes in the viable cell counts and biogenic amine-production ability of Bacillus spp. by treatment of the bacteriocin obtained from LAB

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 된장으로부터 바이오제닉 아민 생성 바실러스균과 박테리오신 생산유산균은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정하였고, 이들 균주들의 혼합 배양으로 제조한 청국장의 이화학적 및 미생물학적 특성을 조사하였다. 총 10종의 시료로부터 바이오제닉 아민을 생성하는 바실러스균은 Bacillus licheniformis DB102, B.

제안 방법

Microtiter plate (Falcon, Becton Dickinson)의 각 well에 각각의 아미노산(2%, w/v)이 첨가된 탈카르복시화 액체배지(100 μl)와 전 배양액(50 μl)을 접종한 후 혐기적인 조건(Anoxomat 8000 system, MART Co.)에서 37°C, 72시간 동안 배양한 후 자색으로 변하면 바이오제닉 아민 생성균으로 판정하였다.
PCR 산물은 전기영동(1.5% agarose gel, w/v)하고 PCR purification kit (Qiagen)로 정제한 다음 DNA sequencer (ABI Prism®3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems)로 분석한 후 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Basic Local Align Search Tool (BLAST) 프로그램 (version 2.0.8.)으로 염기서열의 상동성을 비교하였다.
따라서 본 연구에서는 된장으로부터 분리된 바실러스균주 중에서 바이오제닉 아민 생성능을 확인하였고, 이들에 대한 항균 활성을 나타내는 유산균을 분리 동정하였다. 바이오제닉아민을 생성하는 바실러스균과 항균 활성을 나타내는 유산균과의 혼합 배양으로 청국장을 제조하여 이화학적 특성 및 유해 아민 생성량의 감소 효과를 측정하였다.
바실러스균은 BHI broth, 유산균은 MRS broth에 각각 접종하여 37°C, 24시간 배양 후 얻은 배양액으로부터 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)해서 모은 세포를 PBS (pH 7.0)로 세척하고 난 다음 각각의 균수를 1.0 × 106 CFU/ml으로 조정하였다.
0)를 첨가한 대조구의 혼탁도의 50%를 나타낸 최대 희석배수의 역수로 표시하였다. 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대하여 박테리오신의 항균 활성을 나타낸 유산균을 최종 선발하여 바실러스균과 동일한 조건에서 염기서열 분석을 통해 동정하였다.
바이오제닉 아민 생성 바실러스균의 증식에 대한 유산균이 생산한 유기산 및 박테리오신의 영향을 조사하기 위해 바실러스균은 BHI broth에 접종한 후 35°C에서 24시간 배양하였다.
바이오제닉 아민 함량 분석을 위해 Nova-Pak C18 컬럼(150 × 3.9 mm, Waters)을 사용하였고, 이동상 ammonium acetate (0.1 M, solvent A)와 acetonitrile (solvent B)의 유속은 1 ml/min, 시료는 20 μl로 주입하였으며 254 nm에서 흡광도를 측정하였다.
따라서 본 연구에서는 된장으로부터 분리된 바실러스균주 중에서 바이오제닉 아민 생성능을 확인하였고, 이들에 대한 항균 활성을 나타내는 유산균을 분리 동정하였다. 바이오제닉아민을 생성하는 바실러스균과 항균 활성을 나타내는 유산균과의 혼합 배양으로 청국장을 제조하여 이화학적 특성 및 유해 아민 생성량의 감소 효과를 측정하였다.
배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)해서 얻은 상등액을 0.22 μm membrane filter (Millipore Co.)로 여과한 다음 Eerola 등(1993)과 Mah 등(2003)의 방법을 일부 변형하여 바이오제닉아민 함량을 측정하였다.
선발된 균주는 동정을 위해 DNA extraction kit (Qiagen)로 DNA를 추출 정제한 다음 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 PCR Thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd.)로 반응시켰다.
세포 현탁액 1% (v/v)를 BHI broth에 접종하고 유산균이 생산한 박테리오신(150, 300 AU/ml) 혹은 배양 상등액(200 μl/ml)을 첨가하여 37°C에서 24시간 호기적인 조건에서 배양하였다.
세포 현탁액을 증자된 콩에 1% (v/w)가 되도록 골고루 접종한 다음 80%의 습도 하에서 37°C, 72시간 발효시켜 청국장을 제조하였다.
1 N HCl를 가하여 반복 조작해서 상등액을 모두 합쳐 최종 50 ml에 맞춰 추출 용액으로 사용하였다. 시험 용액의 dansyl chloride를 이용한 유도체화한 후에 앞서 설명한 조건에 따라 HPLC를 이용하여 바이오제닉 아민 함량을 측정하였다.
앞서 바실러스균 분리를 위해 제조한 균질화한 시료 용액 1 ml를 취하여 1% CaCO3 (w/v)가 첨가된 Lactobacilli MRS agar(BD Difco Co.) 평판배지에 접종하여 호기적인 조건에서 37°C, 48시간 배양하였다.
1 N NaOH 표준용액으로 미홍색이 될 때까지 적정하였다. 여기에 포르말린 용액(35~40%) 20 ml를 첨가한 후 pH 8.3이 될 때까지 소요된 0.1 N NaOH 표준용액의 양으로 아미노태 질소 함량을 계산하였다. 암모니아태질소 함량은 암모니아태 질소 중화적정법(Lee et al.
적정산도 측정을 위해 시료 5 g에 동량의 증류수를 가하고 1% (w/v) 페놀프탈레인 지시약을 첨가한 다음 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 그 소비량을 측정한 다음 계산식[산도(%) = 0.1 N NaOH 소비량 × 0.1 N NaOH 역가 × 0.9]/시료량]에 대입하였다.
즉, Trypticase Soy Broth (TSB)에 전구체 아미노산(l-histidine monohydrochloride monohydrate, l-tyrosine disodium salt, l-lysine monohydrochloride 및 l-ornithine monohydrochloride, Sigma-Aldrich, 1 g/L)과 pyridoxal 5-phosphate (1 mg/L)를 첨가한 배지(BA-TSB)에 바이오제닉 아민 생성균을 각각 접종한 다음 35°C에서 24시간 동안 배양하였다.
즉, 바이오제닉아민 생성 바실러스 균주는 Brain Heart Infusion (BHI) broth(BD Difco Co.)에 접종한 다음 37°C, 24시간 배양하여 얻은 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)해서 모은 세포 침전물은 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하고 세포수를 1.0 × 105CFU/ml로 조정하였다.
05 N 황산용액 25 ml를 넣고 증류액을 약 70 ml 정도 모은 후 증류수로 100 ml로 정용하였다. 증류한 시료 100 ml를 500 ml 삼각플라스크에 옮기고 메틸레드-브롬크레졸그린 혼합 지시액 3~4방울을 넣은 다음 용액의 색이 자회색(pH 4.8)이 나타날 때까지 소요된 0.05 N NaOH 용액의 양으로부터 암모니아태 질소의 농도를 계산하였다. 바이오제닉 아민 함량은 Han 등(2007)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
청국장의 미생물학적 및 화학적 특성 : 청국장에 존재하는 세균수 측정을 위해 발효 완료된 시료 10 g에 증류수 90 ml를가하여 스토마커로 균질화하고 일정한 단계까지 십진 희석한 시료 용액 중 바실러스균과 유산균수 측정을 위해선 LB 및 MRS 평판배지에 각각 접종한 다음 37°C에서 24시간 배양 후 생성된 집락수를 계수하여 Log CFU/g으로 나타내었다.
청국장의 제조 : 바이오제닉 아민 생성 바실러스균 단독(대조구) 및 바이오제닉 아민 생성 바실러스균과 박테리오신 생산 유산균의 혼합(실험구)으로 청국장을 제조한 후 청국장의 미생물학적 및 이화학적 특성을 조사하였다. 대두(100 g)를 수세한 후 증류수(1 L)에 24시간 침지한 후 물기를 빼고 121°C에서 30분간 증자 후 40~45°C 전후로 냉각시켰다.
초기 변성 (97°C, 5분), 변성 (94°C, 1분), 풀림(56°C, 1분), 신장 (72°C, 1분 30초) 및 연장 (72°C, 5분) 조건 하에서 35회 반복하여 DNA를 증폭시켰다.
) 평판배지에 접종하여 호기적인 조건에서 37°C, 48시간 배양하였다. 투명환을 생성한 집락을 유산균으로 간주하고 순수 분리 배양한 후 앞서 언급한 방법에 따라 바이오제닉 아민 생성능을 조사하여 음성 반응을 나타낸 균주를 선발하였다. 유산균의 항균 물질 조제를 위해 MRS broth에서 37°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 얻은 배양 상등액 내 유기산의 함량은 Sgouras 등(2004)의 방법에 따라 HPLC(high pressure liquid chromatography) (Shimadzu)로 측정하였다.

대상 데이터

부산 소재 전통 시장 및 대형 마트에서 판매하는 된장 10종을 수집한 후 시료 30 g에 멸균 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS, pH 7.0) 270 ml를 첨가하여 스토마커(3 M Centre)로 약 2분간 균질화 하였다. 내열성 포자 형성균을 얻기 위해 시료 용액을 80°C에서 15분간 가열 처리한 다음 상등액 0.

데이터처리

Data are Means ± SD from triplicate determinations and means with the different letters in the same column are significantly different (P < 0.05) as determined by Duncan’s multiple range test of One-Way ANOVA.
바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대한 박테리오신 농도별 항균 활성에 관한 결과는 SPSS 프로그램(Ver. 12.0)의 Student’s t-test를 통해 실험구와 대조구간에 유의적인 차이(P < 0.05)를 확인하였다.
실험 항목별로 각각 3회씩 실험하여 얻은 결과값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
한편, 바이오제닉아민 생성 바실러스균과 박테리오신 생성 유산균을 혼합하여 제조한 청국장의 미생물학적 및 화학적 특성에 관한 결과는 일원배치 분산분석(One-Way ANOVA)의 Duncan’s multiple range test를 통해 P < 0.05 유의 수준에서 검정하였다.

이론/모형

세포 현탁액 1% (v/v)를 BHI broth에 접종하고 유산균이 생산한 박테리오신(150, 300 AU/ml) 혹은 배양 상등액(200 μl/ml)을 첨가하여 37°C에서 24시간 호기적인 조건에서 배양하였다. 배양액 내 바실러스균의 생균수는 BHI 평판배지에서 표준한천평판배양법으로 측정하였다.
9]/시료량]에 대입하였다. 아미노태 질소는 Formol 적정법(Shon et al., 2001)으로 측정하기 위해 시료 5 g을 취하여 멸균 증류수 50 ml에 현탁시킨 후 상온에서 약 30분간 교반시켰다. 시료 용액은 10,000 rpm에서 15분간 동안 원심분리하고 난 다음 0.
1 N NaOH 표준용액의 양으로 아미노태 질소 함량을 계산하였다. 암모니아태질소 함량은 암모니아태 질소 중화적정법(Lee et al., 2012)으로 측정하기 위해 시료 5 g을 증류수와 혼합 진탕한 후 거즈로 여액과 대두를 분리하였다. 분리된 여액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 20 ml로 정용하고, 적정 시료 용액으로 사용하였다.
유산균의 항균 물질 조제를 위해 MRS broth에서 37°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 얻은 배양 상등액 내 유기산의 함량은 Sgouras 등(2004)의 방법에 따라 HPLC(high pressure liquid chromatography) (Shimadzu)로 측정하였다.
유산균의 항균 물질 조제를 위해 MRS broth에서 37°C, 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 얻은 배양 상등액으로부터 조 박테리오신 용액은 Lim(2017)의 방법에 따라 조제하였고, 박테리오신 용액의 항균 활성은 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대하여 microtiter plate method (Holo et al., 1991)에 따라 측정하였다.
) 평판배지 표면에 도말한 후 37°C에서 48시간 배양하였다. 평판배지에 자란 서로 다른 형태의 집락을 각각 취하여 순수 분리한 다음 Bover-Cid과 Holzapfel (1999)의 방법에 의하여 아미노산 탈탄산 효소 활성을 측정하였다. 즉, 분리 균주의 효소 유도를 촉진시키기 위해 전구체 아미노산(l-histidine monohydrochloride monohydrate, l-tyrosine disodium salt, l-lysine monohydrochloride 및 l-ornithine monohydrochloride, Sigma-Aldrich, 1 g/L)과 pyridoxal 5-phosphate (1 mg/L)를 첨가한 탈카르복시화 액체배지(decarboxylating broth)에서 균 접종 후 37°C에서 24시간 동안 5회 전 배양하였다.

성능/효과

B. licheniformis DB102 및 L. plantarum DLA205와의 혼합 배양 결과, 대조구(바실러스균 단독 배양)에 비해 바실러스균은 약 1.6 log cycle 낮았고, 유산균수는 8.4 ± 2.6 × 108CFU/g에 이르렀으며, pH(5.57 ± 0.33)는 낮아진 반면 산도(0.48 ± 0.06%)는 높아졌다.
바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대해 항균 활성을 나타내는 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리 동정한 결과는 Table 2와 같다. DLA205 균주의 염기서열 분석 결과 99.0%의 상동성을 나타내는 Lactobacillus plantarum으로 동정되었고, 이 균주가 생산한 박테리오신은 B. licheniformis DB102(1,024 BU/ml)와 B. subtilis DB310 (512 BU/ml)에 대해 항균 활성을 나타내었다. DLA501 균주는 L.
amyloliquefaciens DB714 (32 BU/ml)에 대해 항균 작용을 나타내는 박테리오신을 생산하였다. DLA509 균주는 L. fermentum으로 동정되었고 상동성은 100.0%으로 확인되었으며, B. subtilis DB203 (256 BU/ml), B. cereus DB313 (64 BU/ml) 및 B. subtilis DB1020 (2048 BU/ml)에 대한 항균 활성을 나타낸 박테리오신을 생산하였다. DLA703 균주는 L.
subtilis DB1020 (2048 BU/ml)에 대한 항균 활성을 나타낸 박테리오신을 생산하였다. DLA703 균주는 L. acidophilus (상동성 99.5%)으로 동정되었고, 이 균주가 생산하는 박테리오신은 바이오제닉 아민 생성 바실러스균들 중 유일하게 B. megaterium DB1022 (128 BU/ml)에 대해 항균 활성을 나타내었다. DLA804 균주는 98.
megaterium DB1022 (128 BU/ml)에 대해 항균 활성을 나타내었다. DLA804 균주는 98.1%의 상동성을 나타낸 Enterococcus faecalis로 동정되었고, 생산한 박테리오신은 B. pumilus DB209 (8 BU/ml), B. amyloliquefaciens DB714 (512 BU/ml) 및 B. licheniformis DB917 (8 BU/ml)에대해 항균 활성을 나타내었다. 이상의 결과에서 볼 때, 유산균이 생산한 박테리오신의 항균 스펙트럼은 균종에 따라 다르며, 지시 균주의 종류에 따라 박테리오신의 항균 활성에도 큰차이가 있음을 할 수 있었다.
megaterium DB1022의 생균수를 효과적으로 감소시켰으며 그에 따라 카다베린의 생성량도 대조구에 비해 각각 20% (150 BU/ml) 및 40% (300 BU/ml) 정도 낮게 나타났다. E. faecalis DLA804가 생산한 박테리오신 300 BU/ml을 처리한 경우 B.pumilis DB209와 B. amyloliquefaciens DB714의 생균수는 대조구에 비해 각각 1.7과 3.1 log cycle 감소하였으나, B.licheniformis DB917의 생균수 감소 효과는 거의 나타나지 않았다. 게다가 DB714가 생성한 푸트레신 함량은 DLA804 균주의 박테리오신에 의해 유의하게 감소되었으나, DB209와 DB917이 생산한 카다베린과 히스타민의 함량은 대조구와 비슷한 수준이었다.
4 log cycle 이상 감소되었고, 카다베린과 티라민의 생성량도 60% 이상 감소시켰다. L. acidophilus DLA703의 박테리오신 용액도 B.megaterium DB1022의 생균수를 효과적으로 감소시켰으며 그에 따라 카다베린의 생성량도 대조구에 비해 각각 20% (150 BU/ml) 및 40% (300 BU/ml) 정도 낮게 나타났다. E.
subtilis DB310의 균수 및 아민 생성 억제에 대해선 다소 낮게 나타났다. L. brevis DLA501의 박테리오신은 150 BU/ml 이상 처리한 경우 대조구에 비해 유의하게 생균수 감소 및 바이오제닉 아민 생성량 감소 효과가 나타났으나, 활성의 정도는 L. plantarum DLA205보다는 낮게 나타났다. L.
plantarum DLA205보다는 낮게 나타났다. L. fermentum DLA509가 생산한 박테리오신의 항균 활성은 B. subtilis DB1020에 대해 가장 높게 나타나 이들의 생균수는 박테리오신 용액 150 BU/ml 처리에 의해 대조구보다 약 4.4 log cycle 이상 감소되었고, 카다베린과 티라민의 생성량도 60% 이상 감소시켰다. L.
licheniformis DB102보다 낮았다. L. fermentum DLA509와 B. subtilis DB1020을 혼합 배양한 청국장 내 바실러스균의 생균수는 실험 균주들 중 가장 낮은 값을 나타내었고 유산균수도 가장 높게 측정되었으며, pH는 가장 낮은 반면 그에 따라 산도는 가장 높게 측정되었다. 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량의 감소 효과 및 아미노태 질소 함량의 증가량도 유의하게 높았다.
항균 활성을 나타낸 유산균의 박테리오신이 바실러스균의 생균수 및 바이오제닉 아민 생성량에 미치는 영향을 살펴본 결과는 Table 3과 같다. L. plantarum DLA205가 생산한 박테리오신 용액 150 및 300 BU/ml를 처리한 결과, B. licheniformis DB102의 생균수는 대조구에 비해 각각 2.5 및 3.6 log cycle 감소되었고, 카다베린의 생성량도 유의하게 감소되었다. 하지만DLA205의 항균 활성은 B.
pumilus DB209가 분리되었다. 게다가 시료 3에서는 히스타민을 생성하는 B. subtilis DB310, 히스타민과 푸트레신을 생성하는 B. coagulans DB311, 카다베린과 푸트레신을 생성하는 B. cereus DB313이 확인되었고, 시료 7에서는 푸트레신을 생성하는 B. amyloliquefaciens DB714, 시료 9에서는 카다베린과 티라민을 생성하는 B. amyloliquefaciens DB915, 히스타민을 생성하는 B. licheniformis DB917 균주로 동정되었다. 시료 10에서는 티라민을 생성하는 B.
게다가 아미노태 질소 함량(424.63 ± 0.66 mg%)은 증가된 반면, 암모니아태 질소량(143.73 ± 0.08 mg%)과 카다베린의 함량(281.4 ± 22.3 mg/g)은 유의하게 감소되었다.
, 2010). 따라서 바이오제닉 아민 생성량을 줄이기 위해선 발효식품 제조과정 중 유해 아민 생성량이 적은 종균을 사용하거나, 아민 분해능이 있는 균주를 이용함으로써 유해 아민에 의한 독성의 위험을 감소시킬 수 있다. 게다가 유산균이 생산한 유기산이나 박테리오신과 같은 항균물질에 의하여 바이오제닉 아민 생성균의 증식을 억제함으로써 식품 내 아민의 함량을 감소시킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Lim and Lee, 2016).
유산균의 박테리오신은 농도의존적으로 바이오제닉 아민 생성균의 생균수 및 아민 생성능을 유의하게 감소시켰다. 따라서 유해 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타낸 유산균의 증식에 따라 유산균과 바실러스균을 혼합 배양하여 제조한 청국장의 pH, 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량은 대조구에 비해 유의하게 감소되었다.
08 mg%로 발효가 진행됨에 따라 대두의 단백질이 분해됨에 따른 것이라고 보고한 바 있다. 또한 B. subtilis CKB 단독 혹은 L. plantarum ATCC8014와 혼합 배양에 의해 청국장을 제조하여 생균수와 pH 변화를 조사한 결과, 바실러스 균수는 배양 12시간 만에 약 10⁴CFU/g으로 증가되었고 pH는 초기 6.5로부터 96시간 배양 후 7.7로 증가되었다. 반면 유산균과 혼합 배양한 경우 바실러스균수는 단일 배양한 경우와 거의 차이 없었던 반면, 유산균의 균수는 초기(5.
subtilis DB310의 혼합으로 제조한 청국장과 비슷한 수준이었다. 또한 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량 감소율과 아미노태 질소 함량 증가율도 다른 균주들과 혼합 했을 때보다 효과가 낮게 나타났다. 이상의 결과에서 볼 때 유산균과 바실러스균을 혼합하여 청국장을 제조할 경우 바실러스균 단독 배양일 때보다 생균수는 유의하게 낮았는데 이는 유산균과 영양분의 경합에 의하거나 유산균의 증식에 따라 생산된 박테리오신으로 인하여 바실러스균의 증식이 억제된 것으로 추정된다.
lactis, Micrococcus spp. 및 Staphylococcus piscifermentans 등도 소량 생성하는 것으로 확인되었으나, 본 연구에서 실험한 전통 발효 된장 내에는 우점종인 바실러스균들이 바이오제닉 아민 생성량을 증가시키는 원인균으로 확인되었다.
한편, 바실러스균 단독 배양일 때보다 유산균과의 혼합 배양일 때 적정 산도가 더 높게 나타났으며 이는 유산균이 생산한 유기산에 기인하는 것으로 여겨진다. 바실러스균 단독으로 발효한 경우 아미노태 질소 함량은 0.44%인 반면 유산균과 혼합 배양한 경우 0.46%로 나타나 유의한 차이는 없었으며, 암모니아태 질소 함량은 바실러스의 단독 배양과 유산균과의 혼합 배양에 의해 각각 75.6 mg%과 50.4~56.0 mg%으로 나타났다고 보고된 바 있는데 (Ju and Oh, 2009), 이들과 유사하게 본연구 결과에서 보듯이 청국장 제조 시 바실러스균과 항균 물질을 생산하는 유산균과 혼합 배양하게 되면 유기산 생성에 의해 pH는 감소하는 반면, 산도는 증가하게 되며, 박테리오신 등의 항균 물질 생성에 따라 아민 생성균의 증식 억제 및 사멸로 인하여 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량이 감소되었음을 확인하였다.
megaterium DB1022로 동정 되었다. 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대해 항균 활성을 나타낸 박테리오신 생산균은 Lactobacillus plantarum DLA205, L. brevis DLA501, L. fermentum DLA509, L. acidophilus DLA703 및 Enterococcus faecalis DLA804로 확인되었다. 유산균의 박테리오신은 농도의존적으로 바이오제닉 아민 생성균의 생균수 및 아민 생성능을 유의하게 감소시켰다.
반면 유산균과 혼합 배양한 경우 바실러스균수는 단일 배양한 경우와 거의 차이 없었던 반면, 유산균의 균수는 초기(5.0 × 107CFU/g)에서부터 서서히 감소되어 96시간 발효 후에는 9.0 × 105~2.1 × 106CFU/g 정도 검출되었다.
이상의 결과에서 볼 때 유산균과 바실러스균을 혼합하여 청국장을 제조할 경우 바실러스균 단독 배양일 때보다 생균수는 유의하게 낮았는데 이는 유산균과 영양분의 경합에 의하거나 유산균의 증식에 따라 생산된 박테리오신으로 인하여 바실러스균의 증식이 억제된 것으로 추정된다. 발효 과정 중 유산균이 증식함에 따라 유기산이 생성되어 pH는 감소된 반면 산도는 증가하게 되었고, 유해 아민을 생성하는 바실러스균에 대한 항균작용으로 탈탄산 효소의 활성 감소로 인해 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량이 감소하게 된 것으로 판단된다. 한편 바실러스균 뿐만 아니라 유산균에서 기인하는 단백질 분해효소의 활성에 의해 아미노태 질소 함량은 증가된 것으로 사료된다.
licheniformis DB917 균주로 동정되었다. 시료 10에서는 티라민을 생성하는 B. cereus DB1019, 카다베린과 티라민을 생성하는 B. subtilis DB1020, 카다베린을 생성하는 B. megaterium DB1022가 분리되었고 시료별 분리 균주의 염기서열 분석 결과 96.3~100.0%의 상동성을 나타내었다. 이상의 결과, 시료별 내재된 바이오제닉 아민생성 균종에 차이가 있었고, 동일한 균종일지라도 생성하는 바이오제닉 아민의 종류가 상이한 것으로 확인되었다.
전통 발효 된장 10종을 대상으로 바실러스균을 분리한 후 바이오제닉 아민을 생성하는 균주를 선발하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정한 결과 총 6종의 시료에서 유해 아민생성 균주가 존재하는 것으로 확인되었다(Table 1). 시료 1에서는 카다베린을 생성하는 B. licheniformis DB102, 시료 2에서는 티라민을 생성하는 B. subtilis DB203, 카다베린 및 히스타민을 생성하는 B. stearothermophilus DB206, 카다베린을 생성하는 B. pumilus DB209가 분리되었다. 게다가 시료 3에서는 히스타민을 생성하는 B.
아민 분해능이 있는 L. plantarum D-103 균주로 미소 된장을 25°C에서 120일간 발효시켜 제조한 결과, 발효 기간 동안 식염 농도는 10.4%로 일정하게 유지되었고 pH는 6.2에서부터 4.6으로 감소되었다.
subtilis DB1020을 혼합 배양한 청국장 내 바실러스균의 생균수는 실험 균주들 중 가장 낮은 값을 나타내었고 유산균수도 가장 높게 측정되었으며, pH는 가장 낮은 반면 그에 따라 산도는 가장 높게 측정되었다. 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량의 감소 효과 및 아미노태 질소 함량의 증가량도 유의하게 높았다. 하지만 E.
암모니아태 질소 함량은 213.35 ± 0.08 mg%이었는데 이는 B. subtilis MC31 단독으로 발효시킨 청국장의 암모니아태 질소 함량(238.74 ± 0.18 mg%) 보다 낮게 나타나 유산균과 혼합 발효한 경우 이취의 발생을 감소시킬 수 있었다.
acidophilus DLA703 및 Enterococcus faecalis DLA804로 확인되었다. 유산균의 박테리오신은 농도의존적으로 바이오제닉 아민 생성균의 생균수 및 아민 생성능을 유의하게 감소시켰다. 따라서 유해 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타낸 유산균의 증식에 따라 유산균과 바실러스균을 혼합 배양하여 제조한 청국장의 pH, 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량은 대조구에 비해 유의하게 감소되었다.
1%) 등으로 확인되었다. 이 중에서 우점종인 B. subtilis는 바이오제닉 아민 생성능이 비교적 약하게 나타났고, B. coagulans는 다른 바실러스속 균주들에 비해 가장 낮은 바이오제닉 아민을 생성하였는데 이는 본 연구의 결과와 유사하게 발효 장류에서는 바실러스균들이 유해 아민을 주로 생성에 관여하는 것으로 확인되었다.
2로 단독 배양에 비해 다소 낮았는데 이는 유산균의 영향인 것으로 보여진다. 이러한 결과는 청국장의 원료인 대두 내 영양소를 바실러스균이 주로 이용하여 증식하였으며 바실러스균의 급격한 생육으로 인하여 유산균의 증식은 억제된 것으로 추정하여 본 연구 결과와는 다소 차이가 있었다.
0%의 상동성을 나타내었다. 이상의 결과, 시료별 내재된 바이오제닉 아민생성 균종에 차이가 있었고, 동일한 균종일지라도 생성하는 바이오제닉 아민의 종류가 상이한 것으로 확인되었다.
한편, 본 실험에 사용된 총 5종의 유산균 배양 상등액 200 μl/ml를 처리한 경우 바실러스균의 생균수 감소 및 바이오제닉 아민 생성량 저하에 관한 유의할 만한 효과는 나타나지 않았다(결과 미제시). 이상의 결과에서 볼 때 박테리오신의 항균 활성은 유산균의 종류에 따라 바실러스균에 대한 항균 스펙트럼 및 항균 활성에 차이가 있으며, 박테리오신에 의한 바실러스균의 증식이 억제됨에 따라 이들이 생산한 바이오제닉 아민생성량 감소 효과도 나타났다. 하지만 본 연구에 사용된 유산균이 생산한 유산의 함량은 대략 85.
또한 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량 감소율과 아미노태 질소 함량 증가율도 다른 균주들과 혼합 했을 때보다 효과가 낮게 나타났다. 이상의 결과에서 볼 때 유산균과 바실러스균을 혼합하여 청국장을 제조할 경우 바실러스균 단독 배양일 때보다 생균수는 유의하게 낮았는데 이는 유산균과 영양분의 경합에 의하거나 유산균의 증식에 따라 생산된 박테리오신으로 인하여 바실러스균의 증식이 억제된 것으로 추정된다. 발효 과정 중 유산균이 증식함에 따라 유기산이 생성되어 pH는 감소된 반면 산도는 증가하게 되었고, 유해 아민을 생성하는 바실러스균에 대한 항균작용으로 탈탄산 효소의 활성 감소로 인해 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량이 감소하게 된 것으로 판단된다.
licheniformis DB917 (8 BU/ml)에대해 항균 활성을 나타내었다. 이상의 결과에서 볼 때, 유산균이 생산한 박테리오신의 항균 스펙트럼은 균종에 따라 다르며, 지시 균주의 종류에 따라 박테리오신의 항균 활성에도 큰차이가 있음을 할 수 있었다.
전통 발효 된장 10종을 대상으로 바실러스균을 분리한 후 바이오제닉 아민을 생성하는 균주를 선발하여 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정한 결과 총 6종의 시료에서 유해 아민생성 균주가 존재하는 것으로 확인되었다(Table 1). 시료 1에서는 카다베린을 생성하는 B.
본 연구에서는 된장으로부터 바이오제닉 아민 생성 바실러스균과 박테리오신 생산유산균은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정하였고, 이들 균주들의 혼합 배양으로 제조한 청국장의 이화학적 및 미생물학적 특성을 조사하였다. 총 10종의 시료로부터 바이오제닉 아민을 생성하는 바실러스균은 Bacillus licheniformis DB102, B. subtilis DB203, B. stearothermophilus DB206, B. pumilus DB209, B. subtilis DB310, B. coagulans DB311, B. cereus DB313, B. amyloliquefaciens DB714, B.amyloliquefaciens DB915, B. licheniformis DB917, B. cereus DB1019, B. subtilis DB1020, B. megaterium DB1022로 동정 되었다. 바이오제닉 아민 생성 바실러스균에 대해 항균 활성을 나타낸 박테리오신 생산균은 Lactobacillus plantarum DLA205, L.
암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량의 감소 효과 및 아미노태 질소 함량의 증가량도 유의하게 높았다. 하지만 E. faecalis DLA804와 B. amyloliquefaciens DB714의 혼합 배양으로 제조한 경우에는 본 연구에 사용된 바실러스균 중에서 가장 많은 생균수가 측정되었고, pH와 산도는 L.plantarum DLA205와 B. subtilis DB310의 혼합으로 제조한 청국장과 비슷한 수준이었다. 또한 암모니아태 질소 함량 및 바이오제닉 아민 함량 감소율과 아미노태 질소 함량 증가율도 다른 균주들과 혼합 했을 때보다 효과가 낮게 나타났다.
하지만 본 연구에 사용된 유산균이 생산한 유산의 함량은 대략 85.4 ± 1.9~112.4 ± 3.0 mM(결과 미제시)로 측정되었는데, 이 정도의 유산 양으로는 바이오제닉 아민 생성 바실러스균의 균수 및 유해 아민 생성량 감소에는 크게 영향을 미치지 못하였다.
하지만 이들 결과와는 달리 본 연구에서 실험한 유산균의 배양 상등액(200 μl/ml)으로는 바이오제닉 아민 생성 바실러스균의 증식 억제 효과를 얻을 수 없었는데 이는 바실러스균은 유기산에 대한 내성이 강한 포자 형성균으로서 유산균이 생산한 유산의 양으로는 증식과 유해 대사산물 생성을 억제하기 어려운 것으로 추정된다.
6 log cycle 감소되었고, 카다베린의 생성량도 유의하게 감소되었다. 하지만DLA205의 항균 활성은 B. licheniformis DB102에 대한 것보다 B. subtilis DB310의 균수 및 아민 생성 억제에 대해선 다소 낮게 나타났다. L.
청국장은 콩 단백질의 분해 과정 중 탈아미노 반응에 의해 생성된 암모니아태 질소의 함량이 증가할수록 이취가 많이 나므로 이를 변패 또는 이상발효의 지표로 이용한다. 한편 아미노태 질소는 단백질 분해 효소에 의해 단백질이 아미노산으로 분해되는 정도를 나타내므로 청국장이나 된장 등 발효 장류의 구수한 맛과 품질을 나타내는 지표 값으로써 식품 공전 상에는 0.28% 이상 함유되도록 명시되어 있는데(Lee et al., 2014), 본 연구의 결과 바실러스균 단독 배양보다는 유산균과의 혼합 배양에 의해 암모니아태 질소 함량은 감소되었고, 아미노태 질소 함량은 증가되어 공전 기준치보다 높은 것으로 나타났다.
3 mg/g)은 유의하게 감소되었다. 한편, L.plantarum DLA205와 B. subtilis DB310을 혼합한 경우 유산균의 생균수는 B. licheniformis DB102와 혼합했을 때와 비슷한 수준이었으나, 바실러스균의 생균수는 다소 높게 나타났으며, pH, 암모니아태 질소 및 바이오제닉 아민 함량 감소 효과와 산도와 아미노태 질소 함량의 증가량은 B. licheniformis DB102보다 낮았다. L.
한편, 바실러스균 단독 배양일 때보다 유산균과의 혼합 배양일 때 적정 산도가 더 높게 나타났으며 이는 유산균이 생산한 유기산에 기인하는 것으로 여겨진다. 바실러스균 단독으로 발효한 경우 아미노태 질소 함량은 0.
한편, 본 실험에 사용된 총 5종의 유산균 배양 상등액 200 μl/ml를 처리한 경우 바실러스균의 생균수 감소 및 바이오제닉 아민 생성량 저하에 관한 유의할 만한 효과는 나타나지 않았다(결과 미제시).

후속연구

lactis subsp. lactis EF46은 유해 아민 생성균인 S. thermophilus PRI60의 증식 억제 및 히스타민 축적능을 효과적으로 억제하였다고 보고된 바 있어(Tabanelli et al., 2014), 본 연구 결과와 유사하게 특정 유산균이 생산한 박테리오신은 바이오제닉 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었으므로 이들 균주들을 유해 아민 생성 위험이 높은 식품 제조에 활용한다면 아민의 독성위험을 낮추는데 효과적일 것으로 판단된다.
, 2014). 따라서 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타내는 박테리오신 생산 유산균의 이용을 통해 유해 아민의 독성 위험을 낮출 수 있으며, 특히 기능성이 뛰어난 프로바이오틱 유산균을 발효 스타터로 활용한다면 건강에 이로운 안전한 발효 식품 제조가 가능할 것으로 사료된다. 향후에는 식품의 품질 저하를 유발할 수 있는 물리화학적 단독 처리보다는 안전한 천연 항균 물질을 혼용하는 허들 테크놀러지(hurdle technology)를 통해 유해 아민제어 효과를 극대화시킬 수 있는 방법에 관한 연구를 진행할 것이다.
따라서 아민 생성균에 대한 항균 활성을 나타내는 박테리오신 생산 유산균의 이용을 통해 유해 아민의 독성 위험을 낮출 수 있으며, 특히 기능성이 뛰어난 프로바이오틱 유산균을 발효 스타터로 활용한다면 건강에 이로운 안전한 발효 식품 제조가 가능할 것으로 사료된다. 향후에는 식품의 품질 저하를 유발할 수 있는 물리화학적 단독 처리보다는 안전한 천연 항균 물질을 혼용하는 허들 테크놀러지(hurdle technology)를 통해 유해 아민제어 효과를 극대화시킬 수 있는 방법에 관한 연구를 진행할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	분해 효소의 활성이 낮거나 바이오제닉 아민 섭취량이 지나치게 많으면 어떤 아민 중독 중상이 유발되는가?	식품을 통해 섭취된 바이오제닉 아민의 일정량은 체내 아민 산화효소(amine oxidase)에 의해 분해됨으로써 건강을 위협할 정도는 아니지만, 분해 효소의 활성이 낮거나 아민 섭취량이 지나치게 많을 경우에는 안면 홍조, 두드러기, 호흡 곤란 등 아민 중독 중상을 유발하게 된다(Ladero et al., 2010).
	콩으로 만든 장류 내에 주로 함유된 바이오제닉 아민으로 어떤 것이 있는가?	하지만 발효 과정 동안 다양한 미생물들의 아미노산 탈탄산 효소에 의해 발암물질 전구체인 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 콩으로 만든 장류 내에서 다량 검출된다(Santos, 1996). 장류 내에 주로 함유된 바이오제닉 아민인 아그마틴(agmatine), 카다베린(cadaverine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 트립타민(tryptamine), 베타-페닐에틸아민(β-phenylethylamine) 등은 각각 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan), 페닐알라닌(phenylalanine) 등의 아미노산으로부터 생성된다(Shalaby, 1996).
	한국 된장에서 콩의 발효 과정 동안 어떤 세균들이 주로 바이오제닉 아민을 생성하는가?	한국 전통 재래식 된장은 콩으로부터 분해된 비교적 많은 양의 아미노산을 함유하고 있고 이는 바이오제닉 아민 생성을 위한 원료가 되며, 발효 과정 동안 Bacillus sp., Citrobacter sp., Clostridium sp., Klebsiella sp., Escherichia sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., Salmonella sp., Shigella sp., Photobacterium sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp.및 Streptococcus sp. 등의 세균들이 주로 바이오제닉 아민을 생성하는 것으로 보고되고 있다(Brink et al., 1990).

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Tabanelli G, Montanari C, Bargossi E, Lanciotti R, Gatto V, Felis G, Torriani S, and Gardini F. 2014. Control of tyramine and histamine accumulation by lactic acid bacteria using bacteriocin forming lactococci. Int. J. Food Microbiol. 190, 14-23.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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