선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 기존 진단시약에서 주로 사용되고 있는 수입된 horseradish POD대신 한국산 무에서 분리한 anionic POD를 사용하여 o-tolidine과 4AAQEA을 비색기질로 사용하여 glucose 농도를 측정하고자 한다. 또한 읺ucose 검출에 사용되는 POD의 기질연구를 통하여 최대 비색감도를 내는 효소와 기질의 최적조건을 구하여 기존 당 정량 진단시약의 검출 감도를 향상시킬 수 있는 기초자료를 제시하고자 한다.
- 있다. 본 연구에서는 기존 진단시약에서 주로 사용되고 있는 수입된 horseradish POD대신 한국산 무에서 분리한 anionic POD를 사용하여 o-tolidine과 4AAQEA을 비색기질로 사용하여 glucose 농도를 측정하고자 한다. 또한 읺ucose 검출에 사용되는 POD의 기질연구를 통하여 최대 비색감도를 내는 효소와 기질의 최적조건을 구하여 기존 당 정량 진단시약의 검출 감도를 향상시킬 수 있는 기초자료를 제시하고자 한다.
- 본 연구진에서는 1993년도부터 반도체레이저를 광원으로 하는 비색정량분석법을 연구하고 있다.14-16) 이를 이용하면 기존의 분광기보다 간편하고, 저렴하게 비색정량용 장치제작이 가능해지기 때문이다.
제안 방법
- Gucose와 GOD를 반응시켜서 생성된 H2O2를 POD 존재하에 4AA/DEA을 산화축합시킨 후 푸른색의 색소화합물을 형성시켰고 630 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 glucose 농도를 측정하였다. 10mM의 glucose 존재하에 반응시간, pH, 효소농도 및 비색기질의 농도를 변화시켜 가면서 비색반응의 최적조건을 결정하였다.
- 4AA/DEA의 최적 농도 결정을 위하여 lOmNI glucose와 GOD 0.15unit/m/을 반응시킨 후 한국산 무 anionic POD 0.2 unit/m/와 함께 비색시약의 양을 변화시켜가면서 pH 5.0에서 30 분동안 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. 그 결과 비색액의양이 10에서 20μl일 때 최적효소반응이 일어났다(Fig.
- 17) o-Tolidine 법에 의한 glucose 농도측정을 위하여 glucose를 GOD와 반응시켜서 생성된 HQ?를 POD 존재하에서 비색기질인 o-tolidine과 반응시켰고, 최종 발색반응물의 630 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Glucose의 농도를 10mM로 고정하고 반응시간, pH, 효소농도 및 비색기질의 농도를 변화시켜 가면서 비색반응의 최적조건을 결정하였다.
- Guaiac이에 대한 POD의 Km값을 결정하기 위하여 50 mM sodium phosphate (pH 6.0) 완충용액에서 H2O2의 농도를 5 mM로 고정시키고 guaiacol의 농도를 변화시켜 가면서 470 nm 에서 흡광도 증가를 측정하였고, 효소 활성도를 double reciprocal plot하여 Km값을 결정하였다. o-Dianisidine에 대한 POD의 Km값을 결정하기 위하여 50 mM sodium acetate (pH 4.
- 1 N HC1 에 diethylaniline을 1% 용해시킨용액 15mZ에 4-aminoantipyrine 50 mg을 섞어서 사용하였다. Gucose와 GOD를 반응시켜서 생성된 H2O2를 POD 존재하에 4AA/DEA을 산화축합시킨 후 푸른색의 색소화합물을 형성시켰고 630 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 glucose 농도를 측정하였다. 10mM의 glucose 존재하에 반응시간, pH, 효소농도 및 비색기질의 농도를 변화시켜 가면서 비색반응의 최적조건을 결정하였다.
- 6 mM)이고 당뇨환자의 경우 약 200mg/dl로 알려져 있다. o- tolidine 법에 따라 glucose의 농도를 혈중 평균 당 농도이내인 0, 2.5, 5, 7.5, 10mM로 변화시켜 가며 0.15unit/mZ의 GOD 와 반응 시 킨 후 0.43 mM o-tolidine과 함께 한국산 무 anionic POD 0.2unit/m/> 5분동안 반응시켰다. Glucose의 농도증가에 따라 흡광도를 측정하여 검정그래프를 작성한 결과 상관계수 r = 0.
- 0) 완충용액에서 H2O2의 농도를 5 mM로 고정시키고 guaiacol의 농도를 변화시켜 가면서 470 nm 에서 흡광도 증가를 측정하였고, 효소 활성도를 double reciprocal plot하여 Km값을 결정하였다. o-Dianisidine에 대한 POD의 Km값을 결정하기 위하여 50 mM sodium acetate (pH 4.0) 완충용액에서 H2O2의 농도를 5mM로 고정시키고 O- dianisidine의 농도를 변화시켜 가면서 400nm에서 흡광도의 증가를 측정하였고, 효소 활성도를 double reciprocal plot하여 Km값을 결정하였다.
- 그러나 지금까지 상용으로 시판되는 저가형 반도체레이저는 발진파장이 붉은 색으로 제한되어 있기 때문에, 본 장치의 응용을 위해서는 푸른색 비색시약을 필요로 하였다. o-Tolidine을 기질로 사용하면 최대흡수파장 630 nm의 푸른색 화합물을 형성할 뿐만 아니라 4-aminoantipyrine 에 diethylaniline을 첨가하여도 630nm에서 흡수가 일어나기 때문에 본 연구에서는 o-tolidine과 함께 4AA/DEA을 비색기질로 선택하여 당 정량을 실시하였다.
- 사용하였다. o-Tolidine을 비색기질로 사용한 당정량을 실시하기 위하여 glucose를 GOD와 반응시켜서 생성된 H2O2가 POD 존재하에 비색기질인 o-tolidine과 반응하도록 한 후 최종적으로 생성된 비색반응물의 630nm에서의 흡광도를 측정하였다. 최적 pH는 o-tolidine의 농도를 0.
- 15 unit/m/3. 고정시킨 후 0.43 mM의 o-tolidine을 첨가하여 준 후 한국산 무 anionic POD의 양을 변화시키면서 630 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 한국산 무 anionic POD의 양이 0에서 0.
- 14-16) 이를 이용하면 기존의 분광기보다 간편하고, 저렴하게 비색정량용 장치제작이 가능해지기 때문이다. 그러나 지금까지 상용으로 시판되는 저가형 반도체레이저는 발진파장이 붉은 색으로 제한되어 있기 때문에, 본 장치의 응용을 위해서는 푸른색 비색시약을 필요로 하였다. o-Tolidine을 기질로 사용하면 최대흡수파장 630 nm의 푸른색 화합물을 형성할 뿐만 아니라 4-aminoantipyrine 에 diethylaniline을 첨가하여도 630nm에서 흡수가 일어나기 때문에 본 연구에서는 o-tolidine과 함께 4AA/DEA을 비색기질로 선택하여 당 정량을 실시하였다.
- 기질인 Ο-tolidhie의 적정조건을 결정하기 위하여 lOmM의 glucose와 0.15 unit/m/ GOD 및 0.09unit/mZ POD에 o-tolidine 의 양을 변화시키면서 630nm에서의 흡광도를 측정하고 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 그 결과 o-tolidkie의 양이 증가함에 따라 흡광도가 정량적으로 증가하였으므로 이 구간내에서 당의 정량이 가능함을 알 수 있었다.
- POD에 의해서 4AA/DEA과 산화축합하여 푸른색의 색소화합물을 형성하였다. 따라서 비색효소로 한국산 무 anionic POD를 사용하고 4AA/DEA을 비색기질로 사용하여 630 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 당 정량이 가능하였다. 최적 pH 를 구하기 위하여 비색시약(4AA/DEA)의 양을 20|H로 고정한 후 완충용액의 pH를 pH 3.
- 반응시켜서 생성된 HQ?를 POD 존재하에서 비색기질인 o-tolidine과 반응시켰고, 최종 발색반응물의 630 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Glucose의 농도를 10mM로 고정하고 반응시간, pH, 효소농도 및 비색기질의 농도를 변화시켜 가면서 비색반응의 최적조건을 결정하였다.
- 모든 효소반응은 Diode-Array-Detector/UV-VIS Spectrophoto- meter인 SCINCO UV S-2100을 사용하여 측정하였다.
- 4). 이러한 결과를 바탕으로 4AAQEA계에 대한 한국산무 anionic POD의 반응은 pH 5.0의 100 mM sodium acetate 완충용액을 사용하여 실시하였다.
- 진단시약이나 면역반응에서 비색반응의 표지효소로 주로 사용되는 horseradish POD와 본 연구에서 개발한 한국산 무POD의 비색반응성을 비교분석 하기 위하여 합성기질로 주로 사용되는 o-dianisidine과 guaiac 이에 대한 Km값을 결정하였다. Km값은 효소와 기질의 친화도 및 반응성을 나타내는 기준으로서 Rm값이 적을수록 높은 기질친화도를 나타낸다.
- 2A). 최적 GOD 양을 측정하기 위하여 10 mM glucose와 함께 POD를 0.09unit/mZ으로 고정시킨 후 GOD 양을 변화 시켜 가면서 pH 5.0에서 반응시켰다. 그 결과 GOD의 양이 0에서 0.
- 따라서 비색효소로 한국산 무 anionic POD를 사용하고 4AA/DEA을 비색기질로 사용하여 630 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 당 정량이 가능하였다. 최적 pH 를 구하기 위하여 비색시약(4AA/DEA)의 양을 20|H로 고정한 후 완충용액의 pH를 pH 3.0에서 8.0으로 변화시켰다. 그 결과 한국산 무 anionic POD반웅의 최적 pH는 5.
- o-Tolidine을 비색기질로 사용한 당정량을 실시하기 위하여 glucose를 GOD와 반응시켜서 생성된 H2O2가 POD 존재하에 비색기질인 o-tolidine과 반응하도록 한 후 최종적으로 생성된 비색반응물의 630nm에서의 흡광도를 측정하였다. 최적 pH는 o-tolidine의 농도를 0.43 mM로 고정한 후 100 mM sodium acetate 완충용액 (pH 3.0, 4.0, 5.0), 100 mM sodium phosphate 완충용액 (pH 5.0, 6.0, 7.0), 100 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.0, 8.0)을 사용하여 반응액의 pH를 3.0어서 8.0으로 변화시켜가며 결정하였다. 그 결과 o-tolidine산화에 대한 최적 pH는 5.
- 최적 효소량을 결정하기 위하여 10mM의 glucose와 GOD 0.15unit/mZ> 반응시킨 후 비색시약과 함께 한국산 무 anionic POD의 양을 변화시켜 가면서 pH 5.0에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 Fig. 5A에 나타내었다. 또한 같은 조건에서 GOD를 변화시켜 가면서 흡광도를 측정하고 그 결과를 Fig.
- 11-13)한국산 무 뿌리를 믹서로 파쇄한 후 거즈를 통과시켜서 효소액을 추출하고 이 효소액을 황산암모늄으로 90% 포화시켜 4℃에서 수 시간 방치시킨 후 10,000×g에서 20분간 원심 분리하였다. 침전물을 모아 최소 부피의 5 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0) 에녹인 후 5 mM sodium phosphate bufler(pH 6.0)에 대하여 24 시간 투석하였다. 투석된 효소액을 5mM sodium phosphate buffer(pH 6.
대상 데이터
- Glucose와 GOD를 반응시킨 후 생성되는 H2O2는 한국산 무 anionic POD에 의해서 4AA/DEA과 산화축합하여 푸른색의 색소화합물을 형성하였다. 따라서 비색효소로 한국산 무 anionic POD를 사용하고 4AA/DEA을 비색기질로 사용하여 630 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 당 정량이 가능하였다.
- 본 실험에서 사용한 한국산 무(Raphanus sativus L.)는 중 남아산시의 재래시장에서 구입하였고 한국산 무로부터 anionic POD를 분리하여 효소원으로 사용하였다.11-13)한국산 무 뿌리를 믹서로 파쇄한 후 거즈를 통과시켜서 효소액을 추출하고 이 효소액을 황산암모늄으로 90% 포화시켜 4℃에서 수 시간 방치시킨 후 10,000×g에서 20분간 원심 분리하였다.
- 한국산 무에 존재하는 개별 POD isozyme 에 대한 연구로는 효소분리와 특성규명11-13) 및 유전자 수준에서의 연구18-19)가 보고되어 있다. 본 실험에서는 황산암모늄 분별침전과 CM-cellulose ion exchange chromatography를 통하여 분리한 anionic POD를 효소원으로 사용하였다.
- 비색효소원으로는 현재 진단시약반응에 주로 사용되고 있는 horseradish POD 대신 한국산 무에서 분리한 anionic POD를 사용하였다. 한국산 무에는 pH 7.
- 한국산 무 anionic POD를 비색 효소로 사용하여 glucose의 농도를 측정하기 위하여 비색기질로 4AA/DEA을 사용하였다.18)비색시약은 0.
- 한국산 무 anionic POD를 비색 효소로 사용하여 glucose의 농도를 측정하기 위하여 산화기질로 o-tolidine을 사용하였다.17) o-Tolidine 법에 의한 glucose 농도측정을 위하여 glucose를 GOD와 반응시켜서 생성된 HQ?를 POD 존재하에서 비색기질인 o-tolidine과 반응시켰고, 최종 발색반응물의 630 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 한국산 무 anionic POD를 비색 효소원으로 사용하여 glucose 농도를 측정하기 위하여 비색기질로 o-tolidine을 사용하였다. o-Tolidine을 비색기질로 사용한 당정량을 실시하기 위하여 glucose를 GOD와 반응시켜서 생성된 H2O2가 POD 존재하에 비색기질인 o-tolidine과 반응하도록 한 후 최종적으로 생성된 비색반응물의 630nm에서의 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 7A). 4 AA/DEA법을 사용한 경우에도 당 분석구간인 0-15 mM 사이에서 상관계수 r = 0.9963의 좋은 직선성을 보여 주었다(Fig. 7B). 이러한 결과는 한국산 무 anionic POD를 사용한 이 두 가지 방법이 당 분석을 위한 진단시약으로 사용될 수 있음을 보여준다.
- 2unit/m/> 5분동안 반응시켰다. Glucose의 농도증가에 따라 흡광도를 측정하여 검정그래프를 작성한 결과 상관계수 r = 0.9983의 높은 직선성을 보여 주었다(Fig. 7A). 4 AA/DEA법을 사용한 경우에도 당 분석구간인 0-15 mM 사이에서 상관계수 r = 0.
- 9). Km값을 기준으로 비교하였을 때 o-di anisidine 산화의 경우 한국산 무 POD가 horseradish POD보다 약 40여 배의 높은 기질 친화도를 나타냈을 뿐만 아니라 guaiacol산화에 있어서도 한국산 무 POD가 약 2배의 높은 반응성을 나타냈다. 따라서 한국산 무 anionic POD를 비색효소로 사용할 경우 기존진단 시약보다 검출감도가 높은 당 정량반응이 가능할 것으로 예측된다.
- 0에서 반응시켰다. 그 결과 GOD의 양이 0에서 0.15uni1/mZ인 구간에서 흡광도가 균일하게 증가하였으며 그 이후로는 흡광도가 일정하게 유지되었다(Fig. 2B). 이상의 결과를 통하여 당 정량반응에 필요한 한국산 무 anionic POD와 GOD의 최적양이 각각 0.
- 0으로 변화시켜가며 결정하였다. 그 결과 o-tolidine산화에 대한 최적 pH는 5.0 으로 나타났다(Fig. 1). 이러한 결과를 바탕으로 o-tolidine과 POD의 반응은 pH 5.
- 3에 나타내었다. 그 결과 o-tolidkie의 양이 증가함에 따라 흡광도가 정량적으로 증가하였으므로 이 구간내에서 당의 정량이 가능함을 알 수 있었다.
- 0에서 30 분동안 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. 그 결과 비색액의양이 10에서 20μl일 때 최적효소반응이 일어났다(Fig. 6).
- 0으로 변화시켰다. 그 결과 한국산 무 anionic POD반웅의 최적 pH는 5.0으로 나타났다 (Fig. 4). 이러한 결과를 바탕으로 4AAQEA계에 대한 한국산무 anionic POD의 반응은 pH 5.
- 43 mM의 o-tolidine을 첨가하여 준 후 한국산 무 anionic POD의 양을 변화시키면서 630 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 한국산 무 anionic POD의 양이 0에서 0.09 unit/m/°l 구간에서 흡광도가 균일하게 증가하였으나 농도가 이보다 높아지면 흡광도가 일정하게 유지되었다(Fig. 2A). 최적 GOD 양을 측정하기 위하여 10 mM glucose와 함께 POD를 0.
- Km값을 기준으로 비교하였을 때 o-di anisidine 산화의 경우 한국산 무 POD가 horseradish POD보다 약 40여 배의 높은 기질 친화도를 나타냈을 뿐만 아니라 guaiacol산화에 있어서도 한국산 무 POD가 약 2배의 높은 반응성을 나타냈다. 따라서 한국산 무 anionic POD를 비색효소로 사용할 경우 기존진단 시약보다 검출감도가 높은 당 정량반응이 가능할 것으로 예측된다. 또한 비색반응의 기질로 주로 사용되는 o-dianisidine 에 대하여 한국산 무 anionic POD의 반응성이 약 40여 배 높다는 사실은 horseradish POD대신 한국산 무 POD를 사용할 경우 수입 대체효과와 함께 막대한 외화절감효과도 가능함을 보여준다.
- 따라서 한국산 무 anionic POD를 비색효소로 사용할 경우 기존진단 시약보다 검출감도가 높은 당 정량반응이 가능할 것으로 예측된다. 또한 비색반응의 기질로 주로 사용되는 o-dianisidine 에 대하여 한국산 무 anionic POD의 반응성이 약 40여 배 높다는 사실은 horseradish POD대신 한국산 무 POD를 사용할 경우 수입 대체효과와 함께 막대한 외화절감효과도 가능함을 보여준다.
- 이러한 결과는 한국산 무 anionic POD를 사용한 이 두 가지 방법이 당 분석을 위한 진단시약으로 사용될 수 있음을 보여준다. 이상의 결과를 종합하여 o-tolidine법과 4AA/QEA법의 당 검출 감도를 비교해 보면 기질로 4AA/DEA을 사용한 경우 o-tolidine을 사용했을 때보다 모든 glucose농도구간에서 흡광도가 높게 나타났을 뿐만 아니라 육안으로도 더 높은 비색성을 보여주었다.
- 2B). 이상의 결과를 통하여 당 정량반응에 필요한 한국산 무 anionic POD와 GOD의 최적양이 각각 0.09unit/mZ 및 0.15 unit/mZ임을 알 수 있었다.
후속연구
- 7B). 이러한 결과는 한국산 무 anionic POD를 사용한 이 두 가지 방법이 당 분석을 위한 진단시약으로 사용될 수 있음을 보여준다. 이상의 결과를 종합하여 o-tolidine법과 4AA/QEA법의 당 검출 감도를 비교해 보면 기질로 4AA/DEA을 사용한 경우 o-tolidine을 사용했을 때보다 모든 glucose농도구간에서 흡광도가 높게 나타났을 뿐만 아니라 육안으로도 더 높은 비색성을 보여주었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.