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문제 정의
- 1996a, 1996b). 따라서 본 연구는 비교적 식물체재분 화가 용이한 담배를 이용하여 유전자의 발현을 빠르게 확인하여 유용한 식물의 영양 가치 증진을 위한 기초자료를 제공하고자 수행되었다.
- 본 연구는 AmAl 유전자를 주요 작물에도 입시키기에 앞서 담배를 이용하여 AmAl 유전자를 비교적 강하고 constitutive 하게 발현되는 CaMV 35S promoter의 조절을 받도록 vector를 제작하여 담배에 형질전환 시키고 유전자의 발현을 확인하고자 수행되었다.
- 본 연구에서는 필수 아미노산 함량을 많이 포함하고 균형 있게 분포되어 있고, WHO에서 인정하는 기준에 가까운 단백질의 AmAl 유전자를 식물체에 도입시키기 위하여 식물형 질 전환에 널리 이용되는 담배를 이용하여 형질전환 시켜 보았다. 실험 결과 AmAl 유전자가 성공적으로 담배의 게놈 DNA에 도입된 것을 확인할 수 있었고 그 유전자가 mRNA 수준에서 안정하게 발현됨을 확인하였다.
제안 방법
- AmAI 유전자가 담배 식물체의 게놈 DNA에 들어갔는지 확인하기 위해 형질 전환된 담배 중 비교적 성장이 빠른 4개체를 골라 잎으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. AmAI 유전자에 specific 한 primer23과 primer24를 가지고 PCR를 수행한 결과 4개체 모두에서 1.
- Amaranthus hypochondriacus 저장단백 질을 encoding 하는 AmAl 유전자를 RT-PCR 방법을 이용하여 분리하고 특성화하였다. AmAl 유전자를 담배에 형질전환 시키기 위해CaMV 35S promoter와 3 ' NOS를 가지고 있는 식물발현 vector에 subcloning 하고 이재 조합 vector를 이용하여 Agro bacterium-mediated 형질전환 방법을 이용하여 담배에도 입시켰다. 신초는 0.
- Amaranthus hypochondriacus 저장단백 질을 encoding 하는 AmAl 유전자를 RT-PCR 방법을 이용하여 분리하고 특성화하였다. AmAl 유전자를 담배에 형질전환 시키기 위해CaMV 35S promoter와 3 ' NOS를 가지고 있는 식물발현 vector에 subcloning 하고 이재 조합 vector를 이용하여 Agro bacterium-mediated 형질전환 방법을 이용하여 담배에도 입시켰다.
- 2 kb 단편을 확인할 수 있었고 대조 구인 비 형질 전환 담배에서는 같은 크기의 DNA 단편을 확인할 수 없었다. PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAI 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAI 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 하였다 (figure 2). 분석결과는 PCR 결과와 일치하였는데 이것으로 보아 AmAI 유전자가 담배의 게놈 DNA에 성공적으로 도입되었음이 확인되었다.
- cDNA의 5' 부위에 specific 한 primer23 (5'-ATCAGATTAACATAATTTCACAAT-3')과 3'부위에 specific 한 primer24 (5'-TATAATTCTAACAATTATTTT-3')> 가지고 A. hypochondriacus씨앗에서 추출한 총 RNA로부터 RT-PCR를 시행하였다. RT-PCR product# pUC18 vector의 Smal 부위에 cloning하고 AmAl 유전자의 Xbal(5')~ kpnl(3') 단편을 CaMV 35S promotei.
- AmAl 유전자는 Amaranthus?} 씨앗을 형성하는 초기에 많이 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에 & hypochon- driag가 꽃이 피고 씨앗이 맺기 시작할 때부터 씨앗을 수확하였고 총 RNA를 추출하여 RT-PCR를 수행하였다. RT- PCR 결과 1.
- 담긴 H (Nicotiana tabacum cv. Havana)^ 종자를 1 % NaOCl 용액에 15분간 살균하고 멸균수로 4~5회 수세한 후에 sucrose 3%와 agar 0.8%를 함유한 MS 배지 (Murashige and Skoo응, 1962)에 파종하여 25C, 일장 16시간으로 growth chamber에서 배양하였다
- AmAl 유전자를 담배에 형질전환 시키기 위해CaMV 35S promoter와 3 ' NOS를 가지고 있는 식물발현 vector에 subcloning 하고 이재 조합 vector를 이용하여 Agro bacterium-mediated 형질전환 방법을 이용하여 담배에도 입시켰다. 신초는 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L BA, 100 mg/L kanamycin 그리고 250 mg/L cefotaxime 이 첨가된 MS 선발 배지에서 선발했고, 선발된 신초는 식물 생장 조절제를 첨가하지 않고 200 mg/L kanamycin과 250 mg/L cefotaxime0] 첨가된 MS 배지에서 뿌리를 유도하였다. 선발된 담배의 게놈 내의 AmAl 유전자의 존재는 PCR 방법과 hybridization을 이용하여 확인되었고, AmAI 유전자의 발현은 RT-PCR 방법과 Southern blot hybridization을 사용하여 확인되었다.
- 2kbcDNA 단편이 확인되었고, 염기서열 분석을 수행한 결과 이미 발표된 AmAI 유전자의 염기서열과 완전히 일치하였고 이 유전자의 deduced amino acid 조성을 살펴보면 필수 아미노산 함량이 높고 균형 있게 분포되어 있었다. 이 AmAI 유전자를 CaMV 35S promoter와 3, NOS를 가지고 있는 식물발현 vector에 subcloning 하였고 Xbal과 Kpnl제한 효소로 잘라 1.2kb 단편을 확인하였다. 제조된 recombinant vector를 A.
- 2kb 단편을 확인하였다. 제조된 recombinant vector를 A. tumefacience LBA4404에 도입하였고 plasmid DNA를 분리하여 E. coli에 다시 도입한 후, X%I과 Kpnl 제한효소로 잘라 1.2kb 단편을 확인하였다 (figure 1).
- 1985)을 이용하였다. 종자를 기내 발아시킨 후 전개된 담배 잎을 0.5 X 0.5 cm 크기로 자른 다음 Agrobacterium 용액에 20분간 침지하여 접종 후, 1.0 mg/L BA와 0.1 mg/L NAA를 첨가한 MS 고형 배지에 치상하여 25℃, 암소에서 48시간 공조배양 하였다 공조 배양 후에 위와 같은 조성의 배지에 100mg/L kanamycin과 250 mg/L cefotaxime을 첨가한 선발 배지에 치상하여 신초를 유도하였다 선발 배지에서 잎 절편으로부터 분화된 신초는 식물 생장 조절제를 첨가하지 않고 200mg/L kanamycin과 250 mg/L cefotaxime이 첨가된 뿌리 유도 배지에서 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 형성된 형질전환 담배는 화분에 옮겨 순화시킨 다음 유전자 분석에 사용하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72℃에서 1분의 주기로 30회 시행하였고 72℃ 에서 7분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 1.0% agarose gel 전기영동으로 분석하였고, 이젤을 nitrocellulose filer로 옮긴 후 Church buffei를 이용 (Church and Gibert 1984) 하여 혼성화 반응을 시행하였다
- 형질 전환된 담배의 잎을 액체질소를 첨가하면서 마쇄한 다음 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, spectrophotometer# 사용하여 정량하였다. Primer23과 primer24< 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 형질 전환된 담배의 잎을 액체질소를 첨가하면서 마쇄한 후,RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 총 RNA를 추출하고 spectrophotometer# 이용하여 정량하였다. First- strand cDNA synthesis kit (Pharmacia)를 이용하여 first- strand cDNA를 합성한 후 게놈 DNA에서와 같은 조건으로 RT-PCR을 수행하여 분석하고, 이젤을 nitrocellulose filer로 옮긴 후 Church buffer를 이용한 방법 (Church and Gibert 1984)으로 혼성화 반응을 시행하였다.
대상 데이터
- tumefacience LBA4404를 가지고 기내 배양한 담배의 잎 절편과 20분간 침지한 후에 48시간 공조 배양하여 잎 절편을 선발 배지에 계대 배양한 결과, 배양 2주 후부터 치상체의 절단면에서 신초가 분화되기 시작하여 비교적 빠른 분 화 양상을 보였다. 분화된 신초는 뿌리 유도 배지에서 뿌리가 분화되었으며, pot에 이식하여 10개체의 형질전환체를 획득하였다. 일반적으로 Agrobacterium을 이용하여 식물에 형질전환을 시킬 경우 형질전환에 오랜 기간이 소요되는 문제점이 있다.
이론/모형
- 형질 전환된 담배의 잎을 액체질소를 첨가하면서 마쇄한 후,RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 총 RNA를 추출하고 spectrophotometer# 이용하여 정량하였다. First- strand cDNA synthesis kit (Pharmacia)를 이용하여 first- strand cDNA를 합성한 후 게놈 DNA에서와 같은 조건으로 RT-PCR을 수행하여 분석하고, 이젤을 nitrocellulose filer로 옮긴 후 Church buffer를 이용한 방법 (Church and Gibert 1984)으로 혼성화 반응을 시행하였다.
- 담배의 형질전환은 leaf disc 형질전환 방법 (Horsh et al. 1985)을 이용하였다. 종자를 기내 발아시킨 후 전개된 담배 잎을 0.
- 0 mg/L BA, 100 mg/L kanamycin 그리고 250 mg/L cefotaxime 이 첨가된 MS 선발 배지에서 선발했고, 선발된 신초는 식물 생장 조절제를 첨가하지 않고 200 mg/L kanamycin과 250 mg/L cefotaxime0] 첨가된 MS 배지에서 뿌리를 유도하였다. 선발된 담배의 게놈 내의 AmAl 유전자의 존재는 PCR 방법과 hybridization을 이용하여 확인되었고, AmAI 유전자의 발현은 RT-PCR 방법과 Southern blot hybridization을 사용하여 확인되었다.
- 와 3'NOS를 가지고 있는 binary vector인 pMY28의 Xba\^)-Kpn\(3') 부위에 도입하여 발현 vector를 구축하였다. 이 발현 vectoi를 tri- parental mating (Ditta et al. 1980) 방법을 이용하여 A. tumefacience LBA44040]] 형질 전환 시켰다.
성능/효과
- AmAI 유전자가 담배 식물체의 게놈 DNA에 들어갔는지 확인하기 위해 형질 전환된 담배 중 비교적 성장이 빠른 4개체를 골라 잎으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. AmAI 유전자에 specific 한 primer23과 primer24를 가지고 PCR를 수행한 결과 4개체 모두에서 1.2 kb 단편을 확인할 수 있었고 대조 구인 비 형질 전환 담배에서는 같은 크기의 DNA 단편을 확인할 수 없었다. PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAI 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAI 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 하였다 (figure 2).
- AmAl 유전자는 Amaranthus?} 씨앗을 형성하는 초기에 많이 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에 & hypochon- driag가 꽃이 피고 씨앗이 맺기 시작할 때부터 씨앗을 수확하였고 총 RNA를 추출하여 RT-PCR를 수행하였다. RT- PCR 결과 1.2kbcDNA 단편이 확인되었고, 염기서열 분석을 수행한 결과 이미 발표된 AmAI 유전자의 염기서열과 완전히 일치하였고 이 유전자의 deduced amino acid 조성을 살펴보면 필수 아미노산 함량이 높고 균형 있게 분포되어 있었다. 이 AmAI 유전자를 CaMV 35S promoter와 3, NOS를 가지고 있는 식물발현 vector에 subcloning 하였고 Xbal과 Kpnl제한 효소로 잘라 1.
- 2 kb 단편이 확인되었고 비 형질 전환 담배에서는 같은 크기의 DNA 단편을 확인할 수 없었다. RT-PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAl 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAl 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 한 결과, RT-PCR 결과와 동일하였다 (figure 3). 이상의 결과로 볼 때에 담배에 도입된 AmAl 유전자가 안정적으로 발현됨을 알 수 있었다.
- 담배에 AmAI 유전자를 도입시키기 위하여 제조된 재조합 vector를 포함하고 있는 A. tumefacience LBA4404를 가지고 기내 배양한 담배의 잎 절편과 20분간 침지한 후에 48시간 공조 배양하여 잎 절편을 선발 배지에 계대 배양한 결과, 배양 2주 후부터 치상체의 절단면에서 신초가 분화되기 시작하여 비교적 빠른 분 화 양상을 보였다. 분화된 신초는 뿌리 유도 배지에서 뿌리가 분화되었으며, pot에 이식하여 10개체의 형질전환체를 획득하였다.
- PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAI 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAI 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 하였다 (figure 2). 분석결과는 PCR 결과와 일치하였는데 이것으로 보아 AmAI 유전자가 담배의 게놈 DNA에 성공적으로 도입되었음이 확인되었다.
- 본 연구에서는 필수 아미노산 함량을 많이 포함하고 균형 있게 분포되어 있고, WHO에서 인정하는 기준에 가까운 단백질의 AmAl 유전자를 식물체에 도입시키기 위하여 식물형 질 전환에 널리 이용되는 담배를 이용하여 형질전환 시켜 보았다. 실험 결과 AmAl 유전자가 성공적으로 담배의 게놈 DNA에 도입된 것을 확인할 수 있었고 그 유전자가 mRNA 수준에서 안정하게 발현됨을 확인하였다. 따라서 이 결과를 기초로 하여 인간에게 유용한 식물인 상추 감자, 토마토 등의 영양 가치를 증진시킬 수 있을 것으로 기대한다.
- RT-PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAl 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAl 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 한 결과, RT-PCR 결과와 동일하였다 (figure 3). 이상의 결과로 볼 때에 담배에 도입된 AmAl 유전자가 안정적으로 발현됨을 알 수 있었다.
- 형질 전환된 담배에서 AmAI 유전자의 발현을 확인하기 위해 AmAl 유전자에 specific 한 primer23과 primer24를 이용한 RT-PCR를 수행한 결과, 4개체의 형질 전환된 담배 모두에서 1.2 kb 단편이 확인되었고 비 형질 전환 담배에서는 같은 크기의 DNA 단편을 확인할 수 없었다. RT-PCR 결과로 나온 DNA 단편이 AmAl 유전자가 확실한지 확인하기 위하여 AmAl 유전자를 probe로 사용하여 Southern blot analysis를 한 결과, RT-PCR 결과와 동일하였다 (figure 3).
후속연구
- 실험 결과 AmAl 유전자가 성공적으로 담배의 게놈 DNA에 도입된 것을 확인할 수 있었고 그 유전자가 mRNA 수준에서 안정하게 발현됨을 확인하였다. 따라서 이 결과를 기초로 하여 인간에게 유용한 식물인 상추 감자, 토마토 등의 영양 가치를 증진시킬 수 있을 것으로 기대한다.
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