본 연구는 체세포를 이용하여 생산된 복제 한우 수소의 번식능력을 검토하기 위해 실시하였다. 복제 한우 수소(C-38 및 C-39) 또는 일반 한우 종모우로부터 정액을 채취하여 정자의 수 및 동결 전 후의 생존성 등을 살펴보았으며, 정자의 운동성 등은 computer assisted sperm analysis(CASA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 이들의 수정 능력을 확인하기 위하여 체외수정과 인공수정을 각각 실시하였다. 정액 성상에서는 복제 수소들과 일반 종모우 간에 정액의 양, 정자의 농도 및 동결융해 후의 생존성 등에서 차이가 나타나지 않았다. CASA를 이용한 분석에서 운동성, 곡선 운동 속도(VCL), 직선운동 속도(VSL) 및 평균 진행 속도(VAP) 등은 복제 수소의 정액이 일반 종모우의 정액에 비하여 유의적으로 높았다 (p<0.05).체외수정에 따른 수정란의 분화율 및 배반포로의 발달율은 복제 수소와 일반종모우 간에 차이가 나타나지 않았다. 복제소 정액(C-38)을 이용하여 인공수정을 한 5두의 체세포 복제 대리모에서 암 수 각각 한 두씩의 건강한 복제 후대 송아지 2두를 생산하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, 실험에 공시된 복제 수소 개체간의 차이가 나타나기는 하였지만, 복제 수소는 정액 성상과 정자의 운동성 등에서 일반 종모우와 차이가 없었으며, 또한 인공수정을 통해 송아지를 생산함으로써 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다.
본 연구는 체세포를 이용하여 생산된 복제 한우 수소의 번식능력을 검토하기 위해 실시하였다. 복제 한우 수소(C-38 및 C-39) 또는 일반 한우 종모우로부터 정액을 채취하여 정자의 수 및 동결 전 후의 생존성 등을 살펴보았으며, 정자의 운동성 등은 computer assisted sperm analysis(CASA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 이들의 수정 능력을 확인하기 위하여 체외수정과 인공수정을 각각 실시하였다. 정액 성상에서는 복제 수소들과 일반 종모우 간에 정액의 양, 정자의 농도 및 동결융해 후의 생존성 등에서 차이가 나타나지 않았다. CASA를 이용한 분석에서 운동성, 곡선 운동 속도(VCL), 직선운동 속도(VSL) 및 평균 진행 속도(VAP) 등은 복제 수소의 정액이 일반 종모우의 정액에 비하여 유의적으로 높았다 (p<0.05).체외수정에 따른 수정란의 분화율 및 배반포로의 발달율은 복제 수소와 일반종모우 간에 차이가 나타나지 않았다. 복제소 정액(C-38)을 이용하여 인공수정을 한 5두의 체세포 복제 대리모에서 암 수 각각 한 두씩의 건강한 복제 후대 송아지 2두를 생산하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, 실험에 공시된 복제 수소 개체간의 차이가 나타나기는 하였지만, 복제 수소는 정액 성상과 정자의 운동성 등에서 일반 종모우와 차이가 없었으며, 또한 인공수정을 통해 송아지를 생산함으로써 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다.
This study was performed to investigate the reproductive characteristics of the cloned Hanwoo bulls produced by SCNT. The semen ejaculated from the cloned bulls (C-38 and C-39) and normal Hanwoo bull was properly measured the volume, the number of sperm, and the viability of frozen-thawed sperm. The...
This study was performed to investigate the reproductive characteristics of the cloned Hanwoo bulls produced by SCNT. The semen ejaculated from the cloned bulls (C-38 and C-39) and normal Hanwoo bull was properly measured the volume, the number of sperm, and the viability of frozen-thawed sperm. The sperm activity was analyzed using computer assisted sperm analysis (CASA). To analyze fertilizing ability of the cloned bulls, in vitro fertilization and artificial insemination were performed using the frozen-thawed semen. There were no differences in semen volume, sperm concentration, and the viability of frozen-thawed sperm between cloned bulls and normal bull. The difference was statistically significant in total motility, curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL), and average-path velocity (VAP) of both cloned bulls compared to those of normal Hanwoo bull, respectively (p<0.05). The cleavage and blastocyst development rate were not different between the groups. five cloned cows were artificially inseminated using the frozen-thawed semen of C-38, two of them became pregnant. Two second generation calves (one male and one female) were produced. Based on these results, the cloned Hanwoo bulls showed normal reproductive abilities of semen parameters and sperm activity to their comparators and produced cloned calves, although there are some individual differences on the parameters.
This study was performed to investigate the reproductive characteristics of the cloned Hanwoo bulls produced by SCNT. The semen ejaculated from the cloned bulls (C-38 and C-39) and normal Hanwoo bull was properly measured the volume, the number of sperm, and the viability of frozen-thawed sperm. The sperm activity was analyzed using computer assisted sperm analysis (CASA). To analyze fertilizing ability of the cloned bulls, in vitro fertilization and artificial insemination were performed using the frozen-thawed semen. There were no differences in semen volume, sperm concentration, and the viability of frozen-thawed sperm between cloned bulls and normal bull. The difference was statistically significant in total motility, curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL), and average-path velocity (VAP) of both cloned bulls compared to those of normal Hanwoo bull, respectively (p<0.05). The cleavage and blastocyst development rate were not different between the groups. five cloned cows were artificially inseminated using the frozen-thawed semen of C-38, two of them became pregnant. Two second generation calves (one male and one female) were produced. Based on these results, the cloned Hanwoo bulls showed normal reproductive abilities of semen parameters and sperm activity to their comparators and produced cloned calves, although there are some individual differences on the parameters.
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문제 정의
본 연구에서는 체세포 복제 한우 수소의 번식생리학적 능력을 검토하기 위하여 신선 또는 동결 정액의 정액 성상, CASA 방법을 이용한 정자 활동성 관련 요소 및 수정능력 등을 분석하였다.
제안 방법
018 mg/ml epinephrine) 7? 함유된 수정 용 배양액 (Fertilization-TA- LP)을 사용하였다. Mineral oil이 도포된 100 ul 수정용소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 bio15개씩의 정자를 첨가 후 5% COz, 39 ℃ 배양액에 24시간 배양하였다. 수정란은 난구세포를 완전히 제거한 후 0.
체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)가 함유된 TCM- 199(Gibco-BRL)에 10 ug/ml FSH-P(Follitropin-V), 1 pg /ml estiradiol-17 그리고 10 ng/ml EGF를 첨가하혀 사용하였다. 미성숙난자는 4-well dish(Nunc, Denmark)를 사용해 mineral oil。] 피복된 500 μ1 체외 성숙용 배양액에 30~50개의 난자를 침적하여, 39℃, 5% COz 조건의 배양기에서 20시간 동안 체외성숙을 실시하였다. 체외수정은 0.
각각의 정액은 90%와 45% Percoll 층을 이용하여 1, 500 rpm으로 20분간 원심분리하였고, 분리된 정자는 0.6% BSA가 첨가된 정자 처리액(sperm-TALP)을 이용하여 1, 500 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리를 실시하여 처리하였다. 각각의 정자의 활동성은 CASA Program(SAIS ALPHA version 1.
2, Medicalsupply, Co, Korea)을 사용하여 분석하였다. 비교 항목은 운동성 (total motility), 곡선 운동 속도(curvilinear velocity, VCL), 직선 운동 속도(straight- line velocity, VSL), 평균 진행 속도(average-path velocity, VAP), Linearity(LINE) 및 Straightness (STR) 등 6 가지를 3회 반복 측정하였다.
Mineral oil이 도포된 100 ul 수정용소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 bio15개씩의 정자를 첨가 후 5% COz, 39 ℃ 배양액에 24시간 배양하였다. 수정란은 난구세포를 완전히 제거한 후 0.3% BSA가 함유된 CR2aa 배양액 50 pl 소적 당 10개씩 넣어 3일간 배양하였고, 그 후 5% FBS가함유된 50 ul 소적에 옮긴 후 다시 5일간 배양하고 배반포 및 수정란의 각 단계를 확인 관찰하였다.
인공 수정을 이용한 번식능력 확인
인공수정은 복제 수소(C-38)의 동결 정액을 사용하였으며, 동기화 처리된 대리모에 배란 전 13~18시간 사이에 0.5 ml 정액 스트로 1개를 직장질법을 이용하여 자궁경에 주입하였다. 대리모는 체세포 복제 한우 암소 5두를 사용하였다.
채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다. 체외수정 및 체외배양에 사용된 시약은 별도의 표기가 없는 한 Sigma사(St.
대상 데이터
5 ml 정액 스트로 1개를 직장질법을 이용하여 자궁경에 주입하였다. 대리모는 체세포 복제 한우 암소 5두를 사용하였다.
도축장에서 도축된 소의 난소에서 10 ml 주사기에 18 G 주사침을 이용하여 직경 2~6 mm 난포로부터 채취하였다. 채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다.
액체 질소에 보관하였다. 동결 정액에 대한 대조 구는 농협중앙회 한우개량사업소에서 상업적으로 시판하고 있는 일반 한우 종모우(KPN-178)의 동결 정액을 사용하였다.
본 연구에 공시된 체세포 복제 수소 2두는 생후 30개월 이상된 한우로서 생리학적으로 정상이었다. 복제 수소의 정액 성상에 대한 분석에서 사출된 정액의 양은 4.
Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다. 체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)가 함유된 TCM- 199(Gibco-BRL)에 10 ug/ml FSH-P(Follitropin-V), 1 pg /ml estiradiol-17 그리고 10 ng/ml EGF를 첨가하혀 사용하였다. 미성숙난자는 4-well dish(Nunc, Denmark)를 사용해 mineral oil。] 피복된 500 μ1 체외 성숙용 배양액에 30~50개의 난자를 침적하여, 39℃, 5% COz 조건의 배양기에서 20시간 동안 체외성숙을 실시하였다.
채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다. 체외수정 및 체외배양에 사용된 시약은 별도의 표기가 없는 한 Sigma사(St. Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다. 체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)가 함유된 TCM- 199(Gibco-BRL)에 10 ug/ml FSH-P(Follitropin-V), 1 pg /ml estiradiol-17 그리고 10 ng/ml EGF를 첨가하혀 사용하였다.
태아 섬유아세포를 이용해 생산된 복제 수소 C-38(34 개월령)과 C-39(30 개월령) 및 일반 종모우(36개월령)의 정액 채취는 인공질을 이용한 방법을 사용하여 채취하였으며, 정액 성상을 분석한 다음 복제 수소의 정액은 동결하여 액체 질소에 보관하였다. 동결 정액에 대한 대조 구는 농협중앙회 한우개량사업소에서 상업적으로 시판하고 있는 일반 한우 종모우(KPN-178)의 동결 정액을 사용하였다.
11 mg/ml hypo taurine, 0.018 mg/ml epinephrine) 7? 함유된 수정 용 배양액 (Fertilization-TA- LP)을 사용하였다. Mineral oil이 도포된 100 ul 수정용소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 bio15개씩의 정자를 첨가 후 5% COz, 39 ℃ 배양액에 24시간 배양하였다.
데이터처리
6% BSA가 첨가된 정자 처리액(sperm-TALP)을 이용하여 1, 500 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리를 실시하여 처리하였다. 각각의 정자의 활동성은 CASA Program(SAIS ALPHA version 1.2, Medicalsupply, Co, Korea)을 사용하여 분석하였다. 비교 항목은 운동성 (total motility), 곡선 운동 속도(curvilinear velocity, VCL), 직선 운동 속도(straight- line velocity, VSL), 평균 진행 속도(average-path velocity, VAP), Linearity(LINE) 및 Straightness (STR) 등 6 가지를 3회 반복 측정하였다.
본 실험에서 얻어진 자료는 Statistical Analysis System (SAS, USA)를 이용하여 각 처리간 x2 방법을 이용하여유의적 차이를 검정하였다. 유의성 검정은 0.
성능/효과
각각의 비교 실험에서 total motility, VCL, VSL 및 VAP 항목에서는 두 복제 수소의 신선 또는 동결 정액이 일반 종모우 동결 정액의 각 항목보다 유의적 높았다 (p<0.05). 하지만 LINE과 STR 항목에서는 일반 종모우와 복제 수소(C-38 및 C-39)의 동결 정액 간에 통계적 유의성이 인정되지 않았다.
한우 종모우와 비교하여 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다. 또한 복제 수소의 동결 정액을 이용한 번식능력 연구에서도 체외 배 발달이나 인공수정을 통한 후대 생산에서 정상적인 수정 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
복제 수소의 번식생리에 관련된 기초자료를 확보하기 위해 실시한 본 연구에서 정액이나 정자의 성상에서 일반 한우 종모우와 비교하여 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다. 또한 복제 수소의 동결 정액을 이용한 번식능력 연구에서도 체외 배 발달이나 인공수정을 통한 후대 생산에서 정상적인 수정 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
Tecirlioglu 등 (2006)이 체세포 복제 개체를 이용한 연구에서 동결 융해한 정자의 VAP, VCL 및 VSL 등이 신선 정액에 비하여 낮게 나타나는 것으로 보고하였다. 본 연구에서 C-38 개체의 경우, VSL과 VAP 요소는 동결융해 후에 유의적으로 낮아졌으나, STR의 경우 오히려 유의적으로 높아진 것으로 나타났다. 그리고 total motility, VCL 및 LINE 등의 항목은 신성 상태와 동결 융해 후의 상태가 차이가 나지 않았다.
정도로 보고되었다(Lessard 등, 2003; Heyman등, 2004; Tecirlioglu 등, 2006). 본 연구에서도 일반 종모우와 C-38의 경우 정상 범주에 포함이 되나, C-38의 경우다소 많은 정자 수를 확인할 수 있었다. 박 등(2003)은 현재 한우 보증 종모우의 정액 생산 능력은 Brito 등(2002) 이 보고한 정액량 6.
이상의 결과를 종합하여 보면, 실험에 공시된 복제 수소 개체 간의 차이가 나타나기는 하였지만, 복제 수소는 정액 성상과 정자의 운동성 등에서 일반 종모우와 차이가 없음을 알 수 있었고, 또한 인공수정을 통해 송아지를 생산함으로써 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다.
정자의 수정 능력을 확인하기 위하여 체외수정과 인공수정을 실시한 결과, 체외수정에 의한 분할율과 배반포로의 발달율은 모든 개체에서 통계적 유의차가 나타나지 않았다. 이러한 연구 결과는 다른 연구자들의 복제 수소의 정액을 이용한 체외수정 연구들과 유사한 결과라 할 수 있다(Heyman 등, 2004; Shiga 등, 2005).
후속연구
아직까지 동물들에서 CASA를 이용한 정자의 활동성 분석에 활성화 되어있지 않아 본 연구의 결과와 객관적으로 비교할 수 있는 자료가 부족한 것이 사실이다. 따라서 이에 대한 좀 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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