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문제 정의
- 본 연구에서는 이러한 귤피추출물이 치아우식원인균으로 알려진 S. mutans에 미치는 항균효과와 GTase활성에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였으며, 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 그러나 귤피가 민간에서 치료제로 사용되어져 왔으며 차와 가공식품 등으로 지금까지도 사용되고 있지만 구강세균과 관련 연구는 거의 보고된 바가 없다. 이에 본 연구에서는 귤피 추출물이 치아우식 원인균인 S. mutans에 미치는 항균효과와 GTase활성에 미치는 효과을 알아보고 항균, 항우식 천연물질로의 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 각각의 배지에 2회 계대 배양시킨 S. mutans 균주를 20 µl씩 접종하여 37℃ 배양기에서 배양하면서 2, 4, 6, 8, 10, 12 시간 간격으로 Sampling 하여 흡광도 값을 측정하였다.
- 각각의 배지에 2회 계대 배양시킨 S. mutans 균주를 20 µl씩 접종하였다.
- 귤피가루 추출물을 5, 10, 20 mg/ml 농도로 BHI 액체 배지 5 ml에 각각 첨가하여 균주와 함께 배양하여 시간에 따라 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도 값에 비교 했을 때 5 mg/ml의 추출물을 넣은 실험군은 큰 변화가 없었으며, 10 mg/ml의 추출물에서는 6시간부터 흡광도 값이 대조군과 급격한 차이를 나타내는 것을 볼 수 있었으며, 20 mg/ml의 추출물에서도 흡광도 값이 대조군과 급격한 차이를 나타내었다[그림 1].
- 접종 후 37℃ 배양기에서 배양하면서 8, 12시간 간격으로 100 ㎕씩 Sampling 하여 멸균증류수에 10(-6)배로 희석한 후 agar plate에 접종하였다. 그 후 37℃에서 3일 동안 배양 후 귤피가루 추출물의 농도에 따른 시간별 집락수(Colony Forming Unit, 이하 CFU)를 측정하였다. 모든 실험군은 3개씩 반복 실험하여 평균값을 내었다.
- 0으로 조정하였다. 그 후 시료액 총무게의 0.02%에 해당하는 soduim azide를 첨가하여 GTase 조효소액을 제조하였다. 조효소액 0.
- mutans 균주를 20 µl씩 접종하였다. 접종 후 37℃ 배양기에서 배양하면서 8, 12시간 간격으로 100 ㎕씩 Sampling 하여 멸균증류수에 10(-6)배로 희석한 후 agar plate에 접종하였다. 그 후 37℃에서 3일 동안 배양 후 귤피가루 추출물의 농도에 따른 시간별 집락수(Colony Forming Unit, 이하 CFU)를 측정하였다.
- 추출물을 5, 10, 20 mg/ml 농도로 희석한 후 실험군 BHI 액체배지 5 ml에 각각 첨가하였고 control에는 추출물을 첨가하지 않았다. 각각의 배지에 2회 계대 배양시킨 S.
- 추출물을 5, 10, 20 mg/ml의 농도로 희석한 후 실험군 BHI 액체배지 5 ml에 각각 첨가하였고 control에는 추출물을 첨가하지 않았다. 각각의 배지에 2회 계대 배양시킨 S.
대상 데이터
- S. mutans KCTC 3065를 분양받아 Brain Heart Infusion (BHI, Difco, USA) 액체배지에 37℃ 배양기에서 2일간 2회 계대 배양하여 사용하였다.
- 연구 재료는 국내(제주)산 100% 귤피가루를 구입하여 사용하였다. 귤피가루 60 g과 ethanol 600 ml을 혼합하여 상온에서 24시간동안 보관한 후에 초음파를 1시간동안 가해준 뒤 vacuum여과기를 통과시켰다.
데이터처리
- 그 후 37℃에서 3일 동안 배양 후 귤피가루 추출물의 농도에 따른 시간별 집락수(Colony Forming Unit, 이하 CFU)를 측정하였다. 모든 실험군은 3개씩 반복 실험하여 평균값을 내었다. 추출물에 의한 S.
- 05 ml 첨가하였고, Blank에는 2% sucrose 대신 증류수를 첨가하였다. 모든 실험군은 3개씩 반복하여 평균값을 측정하였다. 대조군과 비교한 추출물 함유군의 GTase 활성 저해율은 다음 식을 이용하여 계산하였다.
- mutans 균주를 20 µl씩 접종하여 37℃ 배양기에서 배양하면서 2, 4, 6, 8, 10, 12 시간 간격으로 Sampling 하여 흡광도 값을 측정하였다. 흡광도는 분광광도계에서 600 nm로 측정하였고 모든 실험군은 3개씩 반복하여 평균값을 내었다.
성능/효과
- 12시간 경과 후, 대조군에서는 9.52±0.18 log10 CFU/ml 귤피추출물 5 mg/ml 첨가한 배지에서는 8.38±0.18l log10 CFU/ml, 10 mg/ml 첨가한 배지에서는 7.81±0.32 log10 CFU/ml, 20 mg/ml 첨가한 배지에서는 7.23±0.46 log10 CFU/ml 으로 나타났다.
- 귤피가루 추출물을 5, 10, 20 mg/ml 농도로 BHI 액체 배지 5 ml에 각각 첨가하여 시간에 따라 배양 한 다음, 멸균증류수에 10(-6)배로 희석하여 agar plate에 접종 후, 균주의 성장 억제 효과를 알아보기위해 CFU 값과 대조군에 대한 억제율을 측정한 결과, 각각의 실험군 모두 유의한 변화를 나타냈다(p<0.001).
- 귤피가루 추출물을 5, 10, 20 mg/ml 농도로 배지에 각각 첨가하였을 때 10 mg/ml과 20 mg/ml에서 흡광도 값이 대조군과 급격한 차이를 나타내었으며, CFU를 측정한 결과 추출물을 첨가하였을 때 colony 수가 확연하게 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 12시간 후에 Sampling한 경우, 대조군 대비 5 mg/ml에서 92.
- 농도별 귤피가루 추출물이 S. mutans가 생성하는 GTase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 대하여 추출물의 농도가 높아질수록 흡광도 값이 점차 감소하는 것으로 나타났다. 추출물을 0.
- 귤피가루 추출물을 5, 10, 20 mg/ml 농도로 BHI 액체 배지 5 ml에 각각 첨가하여 균주와 함께 배양하여 시간에 따라 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도 값에 비교 했을 때 5 mg/ml의 추출물을 넣은 실험군은 큰 변화가 없었으며, 10 mg/ml의 추출물에서는 6시간부터 흡광도 값이 대조군과 급격한 차이를 나타내는 것을 볼 수 있었으며, 20 mg/ml의 추출물에서도 흡광도 값이 대조군과 급격한 차이를 나타내었다[그림 1].
- 또한 성장억제율을 측정한 결과, 귤피추출물 5 mg/ml 첨가한 배지에서는 92.83±2.82%, 10 mg/ml 첨가한 배지에서는 97.88±1.27%, 20 mg/ml 첨가한 배지에서는 99.34±0.49%로 나타났다.
- 34%의 억제효과가 나타났다. 이러한 결과로 귤피 추출물은 S. mutans의 성장을 억제하는 항균효과를 가지고 있음을 본 연구에서 확인 할 수 있었다. Lee 등[12]은 Helicobacter pylori에 대한 귤피의 항균활성을 보고한 바 있으며, Shin 등[29]은 식중독균인 Listeria monocytogenes 균주에 대하여 clear zone diameter가 15mm 이상으로 뚜렷한 항균성이 확인된다고 보고한 바 있다,
- 추출물 첨가에 따른 GTase 활성억제효과를 알아보기 위한 실험 결과, 추출물을 첨가하였을 때 GTase 활성이 확연하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 추출물을 0.
- 추출물을 0.3125 mg/ml 처리한 경우 저해율은 8.8±3.8%, 0.625 mg/ml 처리한 경우 9.7±3.0%, 1.25 mg/ml 처리한 경우 25.9±1.0%, 2.5 mg/ml 처리한 경우 30.9±3.3%, 5 mg/ml 처리한 경우 41.6±2.2%로 나타나 그 효과는 추출물의 농도가 높아질수록 증가하였으며 5 mg/ml에서는 약 42%의 강한 활성 저해 효과를 보였다.
후속연구
- 이러한 결과를 토대로 볼 때 귤피는 항균 및 항우식 활성을 나타내는 기능성 천연물질로서 이용가치가 클 것으로 생각된다.
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