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문제 정의
- 11-13) 본 연구에서는 sodium alginate로 Aspergillus niger를 고정화하여 구연산을 산업적으로 생산하고 있으며 부산물로 다량 생산되는 이 beads를 현재까지 알려진 가장 독성이 강한 3대 중금속 중 납흡착에 활용하고자 하였으며 고정화된 A. niger beads의 납흡착 특성을 고찰하였다.
가설 설정
- 1 M NaOH 처리시 Cd과 Ni의 흡착은 거의 촉진 시키지 못하였으나 Pb의 흡착은 상당히 촉진시킨 결과를 얻었다는 결과와 본연구와는 서로 상반된 결과인데, 본 연구에서는 alginate의 carboxyl기가 Ca, Na 및 K와 같은 양이온이 Pb의 흡착을 방해한 결과로 사료된다. Fig. 3에서 이미 검토한 바와 같이 alginate beads에서 70% 그리고 beads에 고정화된 곰팡이 균사가 약 30% 정도 Pb을 흡착한 것으로 보아 0.1 M NaOH의 전처리로 40분 정도에서는 alginate beads가 우선적으로 Pb를 흡착함으로써 효과가 떨어졌으나 더 흡착시간을 연장하면 촉진되는 결과는 없다하더라도 흡착할 수 있는 양이 증가하리라는 가정을 할 수 있다.
제안 방법
- Aspergillus niger의 포자의 준비. 건조된 엿기름 찌꺼기 20g을 100ml Erlenmeyer flask에 넣은 후 수분을 적당히 조절하고 솜마개를 한 후 121℃에서 15분간 살균하고 식힌 다음 감자 사면배지에 보관 중인 A. niger 포자를 접종하고 30℃에서 약 1주간 배양하여 포자를 다량 생성시켰다. 여기에 살균증류수로 현탁하여 포자를 여지로 여과하고 3,000rpm에서 원심분리하여 포자를 모아 다음 고정화 실험에 사용하였다.
- niger 포자를 접종하고 30℃에서 약 1주간 배양하여 포자를 다량 생성시켰다. 여기에 살균증류수로 현탁하여 포자를 여지로 여과하고 3,000rpm에서 원심분리하여 포자를 모아 다음 고정화 실험에 사용하였다.
- Alginate beads의 제조. Fig. 1과 같이 beads제조기를 만들고 이 제조기를 이용하여 beads를 2~2.5 mm크기로 제조하였으며 고정화 담체로는 sodium alginate(SHOWA Chemical Co. LTD) 1g을 250 ml 비이커의 90 ml 살균증류수어 녹여 미리 준비해 둔 포자현탁액 10 ml과 혼합하여 magnetic bar로 회전시키면서 또한 잘 회전하고 있는 250ml 비이커의 1% CaCl2 경화용액에 1% sodium alginate-spore 현탁용액 (final cone, of spore 107~109/ml)을 방울방울 떨어뜨려 완전 구형의 beads를 만들었다. Beads의 크기는 분사기의 직경과 외부공기 사출기의 공기유속에 의해 좌우된다.
- Beads의 크기는 분사기의 직경과 외부공기 사출기의 공기유속에 의해 좌우된다. 바깥주사바늘(12 gauge)로부터 압축산소의 유속을 조절하여 beads의 크기를 조절하였다. 그리고 내부주사바늘(15 gauge)은 1% sodium alginate-spore 현탁용액이 담긴 비이커와 호스로 연결되어 있으며 peristaltic pump로 용액의 양을 조절하였다.
- 납흡착은 250 ml Erlenmeyer flask에 500 ppm 농도의 납용액 50 ml를 분주하여 3일간 배양한 곰팡이 고정화 beads 100개를 넣고 30℃에서 100rpm/min 속도로 부드럽게 40분간 진탕하였다. 납의 정량은 50ml 납용액 중 1ml를 취하여 polarography(EG&G PAR Model 394 Electrochemical Trace Analyzer, EG&G PAR Model 303A SMDE, EG&G PAR Model 305 stirrer, EG&G Prinston Technology, USA)로 정량하였으며14) 납의 흡착량은 용액으로부터 남아있는 납을 정량하여 흡착량으로 계산하였다. 즉, 데이터 처리는 EG&G PAR 프로그램을 사용하여 -0.
- 납의 정량은 50ml 납용액 중 1ml를 취하여 polarography(EG&G PAR Model 394 Electrochemical Trace Analyzer, EG&G PAR Model 303A SMDE, EG&G PAR Model 305 stirrer, EG&G Prinston Technology, USA)로 정량하였으며14) 납의 흡착량은 용액으로부터 남아있는 납을 정량하여 흡착량으로 계산하였다. 즉, 데이터 처리는 EG&G PAR 프로그램을 사용하여 -0.3V~0.6V까지 주사하여 -0.45V 부근에서 납의 peak를 얻었다(EG&G PAR, Application Index). 표준곡선은 셀에 10 ml 의 0.
- 45V 부근에서 납의 peak를 얻었다(EG&G PAR, Application Index). 표준곡선은 셀에 10 ml 의 0.1 M 아세테이트 완충용액 (pH 4.5)을 넣고 마이크로 피펫으로 125, 250, 500 ppm의 농도의 표준용액을 100ul 첨가한 뒤 EG&G BXR MODEL 305 stirrer로 교반하여 잘 혼합한 후 5초동안 안정시키고 분석하여 작성하였다. 공시료는 증류수로 보정하였으며 필요한 경우 이 표준용액들을 희석하여 낮은 농도범위를 측정하는데 사용하였다.
- 공시료는 증류수로 보정하였으며 필요한 경우 이 표준용액들을 희석하여 낮은 농도범위를 측정하는데 사용하였다. 이외의 Cu와 Cd도 0.1 M 아세테이트 완충용액 (pH 4.5)을 사용하여 위와 똑 같은 방법으로 분석하였다.
- niger 고정화 beads의 배양일수의 영향. A. niger 고정화 beads를 구연산 발효배지에 1일에서 7일까지 1일간격으로 진탕배양(150rpmlmin)한 후 각 beads를 여과하고 증류수로 2회 정도 씻은 후 재료 및 방법에서 설명한 납흡착 실험을 한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 균체가 자라지 않은 beads는 반응기의 체류시간 40분 후 약 400 ppm 정도 흡착을 하였으며 1일, 2일 및 3일 정도 포자가 발아하여 자란 beads는 460~485ppm 정도 흡착하였다.
- 흡착시간의 영향. 3일간 구연산 생성배지에서 자란 beads와 발아시키지 않은 beads와 시간별 납흡착량을 비교하여 보았다. Fig.
- Beads수의 영향. 250 mZ Erlenmeyer flask에 구연산 생성배지 50mZ를 넣고 살균 후 beads 100개씩 넣어 3일간 배양한 후 이 beads를 증류수로 2회 정도 씻고 beads수를 50, 100, 150 및 200개로 조합하여 재료 및 방법에 따라 납의 흡착정도를 정량하여 흡착율로 나타내었다.
- 10에 나타나 있다. 그리고 beads의 건조량은 105℃ 오븐에서 유리수분이 없을 때까지 건조하여 g단위로 납의 흡착량을 측정하였으며 일정시간(40분) 동안 흡착된 Pb의 양을 구하였다.
- CaClj, KOH 및 NaOH 전처리에 따른 Pb흡착. Pb이온의 흡착성능을 높이기 위하여 흡착실험 전에 3일간 배양된 A. niger beads를 0.1 M CaCl2, 0.1 M KOH 및 0.1 M NaOH 용액에 각각 담구어 1시간 동안 천천히 교반하면서 전처리하였다. 전처리 후 증류수로 여러번 씻고 탈수한 후 Pb 흡착 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 미생물과 배지. 본 실험에 사용한 구연산 생산균인 A niger KCTC 6144는 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 분양받았으며 감자 사면배지에 1주일 간격으로 계대배양하여 본 실험에, 사용하였다. 그리고 beads에 고정화된 포자의 발아 생육 배지로는 구연산 생성배지인 12% sucrose, 0.
- 본 실험에 사용한 구연산 생산균인 A niger KCTC 6144는 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 분양받았으며 감자 사면배지에 1주일 간격으로 계대배양하여 본 실험에, 사용하였다. 그리고 beads에 고정화된 포자의 발아 생육 배지로는 구연산 생성배지인 12% sucrose, 0.5% NH4NO3, 0.1% KH2PO4, 및 0.025% MgSO4를 사용하였다.
- 납흡착 실험 및 정량. 사용된 중금속은 덕산약품(주) 1급시약인 lead nitrate, cupric nitrate 및 cadium nitrate를 사용하여 증류수에 필요한 농도로 조제하여 사용하였다. 납흡착은 250 ml Erlenmeyer flask에 500 ppm 농도의 납용액 50 ml를 분주하여 3일간 배양한 곰팡이 고정화 beads 100개를 넣고 30℃에서 100rpm/min 속도로 부드럽게 40분간 진탕하였다.
- Effect of culture time on lead uptake. The biomass of immobilized A. niger beads was prepared with citric acid medium (12% sucrose, 0.5% NH4NO3, 0.1% KH2PO4 and 0.025% MgSO4). 100 beads in 50 mZ lead solution of 250 ml Erlenmeyer flask was used, and initial concentration of lead solution and adsorption time of lead were 500 mg/l, and 40 mins, respectively.
성능/효과
- 1,7,8) 새로운 흡착제로서 미생물은 저렴한 가격으로 다량 얻을 수 있고 미생물을 이용하여 수용액으로부터 중금속을 분리시 중금속의 흡수와 탈착이 비교적 빠른 시간 내에 이루어지며 중금속의 선택적 분리가 용이하므로 기존의 방법보다 더 효율적일 수 있다. 그러나 이러한 생흡착제를 이용하여 큰 규모로 중금속을 처리하고자 할 경우 중금속의 제거가 신속하여야 하며 용액으로부터 생흡착제의 분리회수가 쉬워야 하고 생흡착제의 재사용이 가능하여야 한다.
- A. niger 포자를 alginate로 고정화 후 beads를 경화용액에 장기간 보관할수록 납의 흡착량은 감소하였는데(여기서는 data를 제시하지 않음), 곰팡이 포자를 고정화한 beads를 경화용액에 약 15일간 보관 후 구연산 생성배지에서 3일간 발효 후 이 beads로 납의 흡착량을 측정한 결과, 흡착체류시간 약 30분만에 150 ppm 흡수하고 곰팡이가 자라지 않은 beads는 더 이상 흡착이 일어나지 않았으며 곰팡이가 자란 beads는 흡착이 계속 되었으나 3시간 지난 후 최대 양인 250 ppm 정도로 납을 흡착하였다. 곰팡이 포자를 alginate로 고정하자마자 바로 구연산 발효배지에서 3일간 발효 후 생성된 beads로 체류시간 30분에서 납의 흡착량과 비교해보면 150 ppm과 350 ppm으로 200 ppm 정도의 차가 발생한다.
- 이는 경화용액에 장기간 보관으로 beads 내의 납을 흡착할 수 있는 carboxyl 기의 구조적 변화로 납의 흡착량이 감소하였다고 사료된다. 결론적으로 말해서 alginate beads로 납의 흡착 실험시 반드시 제조 후 곧장 사용하는 것이 바람직하다.
- 곰팡이를 alginate로 고정화하여 납 흡착에 관한 보문이 없어 직접 흡착량을 비교할 수는 없으나 식품공업에 많이 이용되는 Saccharomyces cerevisiaei alginate로 고정화한 beads로부터의 납회수량11)과 비교해 보면 alginate에 고정화되어 있는 효모에 의한 순수한 흡착된 양은 50% 정도 되는 것으로 나타났는데, 본 연구의 30%보다 약간 높았다. 이는 alginate에 고정화된 효모의 농도는 beads 내부에서 출아로 증식할 경우 자유배양의 경우와 비교하여 70배나 증가하였다고 한다.
- 중금속 흡착에 있어서 pH는 균체의 흡착부위와 금속이온간의 물리, 화학적인 상호관계에 영향을 끼치기 때문에 각 금속별 최적 흡착 pH는 다양하게 나타날 수있다. 구연산 발효배지에서 3일간 자란 A. niger beads 100개를 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9로 조정한 납용액 50ml(초기 납농도를 500ppm)에 넣고 40분 동안 각 pH별로 흡착시키고 납에 대한 흡착능을 조사한 결과(Fig. 4), pH 4.0에서부터 흡착량이 증가하여 pH 6.0에서 최고 흡착을 나타냈고 pH 7.0부터 흡착량이 줄어들었으나 pH 7.0부터는 경미하게 납의 침전이 일어나기 시작하여 pH 8.0에서는 그 정도가 좀더 심하였다. 따라서 beads의 흡착만에 의한 적정 초기 pH는 4~7로 그 이상의 pH에서는 사실 실험이 불가능할 정도로 침전이 일어났다.
- 0에서는 그 정도가 좀더 심하였다. 따라서 beads의 흡착만에 의한 적정 초기 pH는 4~7로 그 이상의 pH에서는 사실 실험이 불가능할 정도로 침전이 일어났다. Kuyucak와 Vblesk15)는 수용액 내의 수소이온이 흡착제의 결합부위에 대하여 중금속이온과 경쟁관계이고 중금속이온의 강도를 변화시켜 흡착제의 활성에 영향을 끼치고 또한 수소이온은 중금속이온에 비하여 흡착제의 결합부위와 친화력이 크기 때문에 중금속을 탈착시키는 역할을 하여 중금속 흡착을 저해한다고 하였다.
- Zoogloea ramigera16) 경우 세포표면의 carboxylate, phosphate, amino group과 polymer가 음전하를 띄다가 pH가 등전점 이하로 낮아지면 양전하를 띠게 되어 양이온인 중금속과 결합이 어려워 낮은 pH에서는 흡착량이 줄어드는 것으로 고찰되었다. 본 결과에서도 beads의 음이온인 carboxyl기가 산성하에서는 비이온형으로 변화여 양이온인 납의 흡착이 감소하는 것으로 사료된다. 또한 beads에 고정화된 곰팡이균사에 납흡착도 pH의 변화에 따라 상당히 영향을 받지않았나 생긱된다.
- 납흡착에 있어서 온도의 영향을 살펴본 결과는 Fig. 5에서와 같이 곰팡이의 최적 생리온도인 35℃에서 최고의 납흡착율을 나타내었으며 이 온도보다 5℃가 낮은 곳에서는 납흡착율이 15% 정도 떨어졌으나 35℃보다 l0℃나 높은 온도에서는 그 흡착율은 거의 5%정도 감소하여 열 안정성을 나타었다.
- niger beads에 의한 중금속의 흡착. Pb, Cu 및 Cd의 초기농도를 750 ppm/ml로 조정하여 재료 및 방법에서의 납흡착 실험과 동일한 조건에서 수행한 결과 Fig. 7에서와 같이 A. niger를 sodium alginate로 고정화한 beads는 Pb에 대한 친화력이 가장 좋았으며 다음으로 Cu, Cd 순이었다. Ahn과 Suh19)의 Sacchammyces cerevisiae 균체에 의한 중금속의 흡착능력 순서도 본 연구의 결과와 일치하였으며 보통 효모생균체에 의한 중금속의 친화력은 Pb와 Cu순으로 흡수가 잘되는 것으로 나타났다.
- niger균체17)에 의한 Pb, Cd 및 Ni의 흡착실험에서 pH에 따라 약간 다르게 나타났으나 pH 4, 5, 6에서는 Pb, Cd순으로 흡착이 잘되었다고 하였다. 결론적으로 효모나 곰팡이 균체에 의한 중금속 흡착실험에서 본 실험에서와 마찬가지로 Pb가 가장 잘 흡착되는 것으로 나타났다.
- Fig. 8을 보면, 비처리구에 비해 모든 처리구가 전처리의 효과가 없는 것으로 나타났는데, 0.1 M CaCl2와 0.1 M NaOH 처리구는 비처리구에 비해 납 흡착율을 약 20% 정도 저해된 80%였으나 0.1 M KOH처리구는 비처리구에 비해 Pb 흡착율이 80%나 떨어진 20%로 나타났다.
- 9에 나타내었다. 탈착시 가장 많이 사용하는 염산의 농도인 0.1 M HC1 로 30분간 탈착한 결과 그림에서 처럼 약 80%정도 탈착되었으며 20% 정도는 그냥 beads 내부에 잔존하였다. 이 beads를 또 2차 흡탈착을 반복한 결과 1차에 비해 흡착율이 70% 정도로 10%정도 떨어졌다.
- Saccharomyces cerevisiae를 alginate로 캡슐고정화하여 납의 흡착량을 조사한 실험과 비교해 보면 초기 납의 농도가 낮은 100 ppm에서는 Saccharomyces cerevisiae 캡슐이 g당 50 ppm으로 본 연구의 20 ppm 결과보다 높았으나 초기농도 500 ppm에서는 거의 같은 80ppm 정도로 흡착을 하였다.13)이 결과는 효모캡슐보다 곰팡이 beads가 납과의 친화력이 다소 떨어진다는 것을 의미한다.
- 13)이 결과는 효모캡슐보다 곰팡이 beads가 납과의 친화력이 다소 떨어진다는 것을 의미한다. Kim과 Park11)의 연구 결과와 비교해 보면 100 ppm으로 낮은 농도에서는 비슷한 결과로 나타났으나 고농도인 500 ppm에서는 효모캡슐은 약 50 ppm 정도 흡착하였으나 본 연구의 곰팡이 beads는 80 ppm 정도로 흡착량이 더 높았다.
- 곰팡이 균사의 생육상태를 관찰하였는데(여기서는 사진은 제시하지 않았음), 2일 배양 후 곰팡이 균사가 마치 beads의 공으로부터 곰팡이 균사가 심어진 것처럼 내부로부터 밖으로 많이 뻗어 나와 있으며 이 때 beads의 크기는 4 mm 정도로 커졌으며 4일 후에는 균사의 정도가 더 길어졌어 6.5~8mm로 커졌다. 시간이 경과함에 따라 beads에서 계속 균사는 자라났지만 진탕으로 균사가 끊어지기 시작하여 6일 이후에는 배양액에 끊어진 균사가 좁쌀 모양으로 엉기기 시작하였다.
후속연구
- 이렇게 5회 반복 후 곰팡이 beads를 눈으로 살펴본 외관은 전혀 문제가 없어 보였으며 Kim과 Park11)은 효모를 alginate로 고정화한 capsule을 30회 반복한 후 캡슐이 약간씩 찌그러 들기 시작하였으나 50회까지도 흡탈착능에는 아무런 변화가 없었다고 하였다. 본 연구에서도 6회 이상은 사용해 보지 못했지만 Kim과 Park의 결과와 유사하리라 생각되며 캡슐의 강도와 beads 내의 곰팡이 균사의 변화 등에 관한 형태학적 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각한다.
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