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문제 정의
- 이 등(1999)에 의하면 영지의 액체 배양에서도 ammonium phosphate가 영지의 액체 배양 중 균사체 및 세포외 다당 생산에 있어 중요한 역할을 하며, 따라서 ammonium phosphate 첨가 농도의 적정 조절로 최적 균사 생육 및 세포외 다당 생산이 가능한 것으로 보고한 바 있다. 본 연구에서는 영지의 액체 배양 중 이 ammonium phosphate의 첨가에 따른 균사체의 다양한 형태 변화를 화상 분석하여 해석하였고, 이로부터 영지 액체배양 중의 균사 형태학적 특성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- Ammonium phosphate 첨가의 유무에 따라 균사의 형태 변화가 현저하였으므로 이의 첨가 농도를 달리하여 균사 형태의 배양 경시변화를 관찰하고, 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 접종 후 배양 1일에는 O~llg/Z의 ammonium phosphate를 첨가한 모든 처리구에서 펠렛 형태의 균사체 생육이 관챁되었다.
- G. lucidum의 액체배양 중 균사체의 형태를 배지조성 및 배양 조건을 달리하여 영상분석하였으며, 그 결과 관찰된 다양한 형태를 Fig. 1과 2에 나타내었다. Fig.
- 분석 시 camera 로 촬영한 화상은 640x480 pixels 및 256 grey level의 해상도로 촬영하였으며, 오차를 최소화하기 위하여 400x400 pixels로 수정하였다. Image software(Optimas 6.1)를 이용하여 면적, 길이, 직경, 원형도 등 각종 형태변수를 구하였으며, fractal 차원은 면적 및 둘레길이 값으로부터 다음 식 (1)을 이용하여 계산하였다(Aratani et al., 1988).
- 균사의 형태 관찰을 위하여 시료 1 m/를 무작위로 취 한 다음, glacial acetic acid 5 m/ 와 50%(v/v) ethanol 200 ml를 함유한 13 mZ의 40% form aldehydes. 고정시켜 20배로 희석한 후, slide glass에 희석한 시료 0.5 ml를 분사하여 통기 건조하였고, absolute al cohol로 수세한 다음, methylene blue로 염색하여 형태관찰용 시료로 하였다(Packer and Thomas, 1990). Glass cubic (가로 4cmx세로 3cmx높이 1.
- 균사체 형태는 image capturing board를 사용하여 image analysis system(Optimas Co., USA)으로 분석하였다. 장치는 CCD camera(Panasonic, wv-CP410) 또는 microscope (Olympus, CHS-213E), PCI video frame grabber(FlashPoint Ver.
- 균체량은 배양액을 10, 000xg에서 15분간 원심분리하고 침전된 균사체를 filter paper(No. 2, Advantec)로 여과한 다음, 증류수로 2~3회에 걸쳐 수세하였고, 70℃에서 24시간 건조한 후, desiccator에서 항량이 될 때까지 방치하면서건 조 중량(mycelial dry weight; MDW)을 즉정하여 정량하였다. 세포외 다당은 원심분리 (IQOOOxg, 15분)하여 균사체를 제거한 후 얻은 배양 여액에 2배 량의 acetone을 가하여 침전물을 얻었으며, 이를 70℃에서 24시간 건조한 다음 중량을 측정하여 조 다당(crude exo-polysaccharide, EPS)으로 정량하였다.
- 특히, 원형도 값은 폘렛 표면의 균사 생장의 정도를 간접적으로 추측할 수 있을 것으로 판단되었다. 따라시, 이를 보다 면밀히 검토하기 위하여 ammonium pho-sphate# (Mlg/Z로 첨가하였을 때 펠렛 표면의 균사 생육의 형태를 현미경으로 확대 관찰하였으며, 그 결과를 Fig.8에 나타내었다. 그림에서와 같이, ammonium phosphate를 3g/Z 첨가하였을 때, 펠렛 표면의 균사생육 정도가 고농도첨가 시보다 왕성함을 관찰할 수 있었다.
- lucidum의 액체배양에 의한 세포외 다당 생산의 최적 배지로 보고한 배지이다. 배지는 121℃에서 15분간 가압 살균 후 사용하였고, 살균 시 염의 침전을 방지하기 위하여 탄 소원, 질소원, 무기염류는 각각 분리 살균한 후 혼합하여 사용하였다. pH는 살균 후 0.
- 버섯의 액체배양에 의한 균사체 및 세포외 다당 발효의 안정성과 생산성 증가를 도모하기 위하여, 영지(Gmoderg lucidum ASI 7004)의 액체배양 중, 배지조성(0~llgll)의 ammonium)을 달리하여 균사체 형태 및 분화의 경시 변화를 영상분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 배지 조성 및 배양 조건에 따른 균사체 형태의 배양경시변화를 영상 분석한 결과, non-branched long filamentous mycelium, non branched short mycelium, branched long filamentous my celium, branched short mycelium, entangled mycelium 및 각종 clump의 필라멘트 형태와, smooth pellet, rough pellet 및 hollow rough pellet의 폘렛 형태 등, 다양한 형태를 관찰할 수 있었다.
- 2, Advantec)로 여과한 다음, 증류수로 2~3회에 걸쳐 수세하였고, 70℃에서 24시간 건조한 후, desiccator에서 항량이 될 때까지 방치하면서건 조 중량(mycelial dry weight; MDW)을 즉정하여 정량하였다. 세포외 다당은 원심분리 (IQOOOxg, 15분)하여 균사체를 제거한 후 얻은 배양 여액에 2배 량의 acetone을 가하여 침전물을 얻었으며, 이를 70℃에서 24시간 건조한 다음 중량을 측정하여 조 다당(crude exo-polysaccharide, EPS)으로 정량하였다.
- 영지 액체배양 중 균사 형태 변화의 보다 정량적인 고찰을 위해서 fractal 차원과 원형도를 조사하였다. Fig.
- 5 wm의 조건하에서 실시하였다. 이때, 통기로 인하여 발생한 거품은 Antiform 289(Sigma)를 사용하여 제거하였고, 배지 중 ammonium phosphate는 0~11 gll의 농도범위에서 변화시키면서 실험하였다.
대상 데이터
- lucidum ASI 7004이다. PDA(Difco) 평판 배지에서 30℃로 7일간 배양한 후 4℃에서 보존하였고, 3개월마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 전 배양액은 균질기(동양(주), model 0820)로 30초 동안 균질화시켜 본 배양의 접종용으로 사용하였고, 매 실험마다 새로이 배양하여 사용하였다. 본 배양은 이 둥(1998) 이 자체 제작한 31 용량(work- ing volume:2l) air-lift fermenter를 사용하여 접종량 5% (v/v), 온도 30℃, pH 5, 통기속도 2.5 wm의 조건하에서 실시하였다. 이때, 통기로 인하여 발생한 거품은 Antiform 289(Sigma)를 사용하여 제거하였고, 배지 중 ammonium phosphate는 0~11 gll의 농도범위에서 변화시키면서 실험하였다.
- 본 연구의 사용 균주는 농촌진흥청 농업과학기술원 보관 균주인 G. lucidum ASI 7004이다. PDA(Difco) 평판 배지에서 30℃로 7일간 배양한 후 4℃에서 보존하였고, 3개월마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 시료의 화상분석을 위한 camera의 노출, 명암, arithmetic operation 및 threshold 범위 등의 화상분석 조건은 Table 1과 같다. 분석 시 camera 로 촬영한 화상은 640x480 pixels 및 256 grey level의 해상도로 촬영하였으며, 오차를 최소화하기 위하여 400x400 pixels로 수정하였다. Image software(Optimas 6.
- , USA)으로 분석하였다. 장치는 CCD camera(Panasonic, wv-CP410) 또는 microscope (Olympus, CHS-213E), PCI video frame grabber(FlashPoint Ver. 3.11, Integral Tech. Inc), image software(Optimas 6.1, Optimas Co.)로 구성되었다. 균사의 형태 관찰을 위하여 시료 1 m/를 무작위로 취 한 다음, glacial acetic acid 5 m/ 와 50%(v/v) ethanol 200 ml를 함유한 13 mZ의 40% form aldehydes.
성능/효과
- 접종 후 배양 1일에는 O~llg/Z의 ammonium phosphate를 첨가한 모든 처리구에서 펠렛 형태의 균사체 생육이 관챁되었다. Ammonium phosphate의 첨가 농도가 낮은 경우(<3gll)에는 배양 시간이 경과하면서 펠렛의 크기는 작고 빈도수가 증가되었으며, 배양 2일 후부터 필라멘트 형태의 균사 생육이 관찰되기 시작하였고, 배양이 더욱 진행됨에 따라 필라멘트 형태의 균사형태가 주로 관찰되었다. 이와 같은 배양 중의 형태 변화는 P.
- 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 균사 생육은 ammonium phosphate 농도 1~3 g/Z에서 최대 값을 가지나, 세포외 다당 생성은 ammonium phosphate의 농도가 증가하면 점차 감소함을 알 수 있다. 결국, 적정 농도의 am monium phosphate 첨가로 G. lucidum의 액내배양 시, 안정성이나 발효 생산성의 제어가 가능할 것으로 판단되었다.
- 또 정지기에서 smooth pellet 및 균사 fig의 증가와 함께 rough pellet의 감소가 관찰되었다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 ammonium phosphate의 첨가 농도가 3g/l 이상의 경우에는 배양이 진행됨에 따라 주로 펠렛형태로의 균사 생육이 관찰되었고, 균사체의 빈도수 또한증가되었다. 또 7 g/Z 이상의 ammonium phosphate를 첨가한 경우에는 pellet의 크기는 커지는 반면, 그 빈도수는 이보다 낮은 농도의 ammonium phosphate 첨가 시보다 낮은 것을 관찰할 수 있었다.
- 그러나, ammonium phosphate의 무첨가 시에는 배양 경과에 따라 hairy pellet => clumped mycelium => entangled mycelium의 형태로 분화된 반면, ammonium phosphates] 첨가 시에는 배양 시간의 경과에 따라 펠렛의 크기가 증가하였고, 펠렛 표면의 균사생육이 감소하였으며, 전 배양기간 중 펠렛 형태를 유지하였다. 따라서 배양액 내 고농도의 ammonium phosphate는 펠렛 형성이나 펠렛의 크기와 밀접한 관계를 가짐을 알 수 있는데, 균사체 생육 및 배양 생성물인 세포외 다당과도 밀접한 관계를 보였다.
- 16으로, 기대할 수 있는 바와 같이 필라멘트형 및 펠렛형 균사체의 중간 값을 나타내었다. 따라서 fractal 차원은 펠렛과 필라멘트형이 함께 존재하는 각종 균사 형태를 구분하는 지표 값으로 매우 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각되었다. Patankar 등(1993)은 필라멘트 및 펠렛형 증식의 fractal 차원은 각각 2.
- 그러나, ammonium phosphate의 무첨가 시에는 배양 경과에 따라 hairy pellet => clumped mycelium => entangled mycelium의 형태로 분화된 반면, ammonium phosphates] 첨가 시에는 배양 시간의 경과에 따라 펠렛의 크기가 증가하였고, 펠렛 표면의 균사생육이 감소하였으며, 전 배양기간 중 펠렛 형태를 유지하였다. 따라서 배양액 내 고농도의 ammonium phosphate는 펠렛 형성이나 펠렛의 크기와 밀접한 관계를 가짐을 알 수 있는데, 균사체 생육 및 배양 생성물인 세포외 다당과도 밀접한 관계를 보였다. 즉 Fig.
- 값을 나타내었다. 따라서' fractal 차원은 균사 형태의 변화를 측정하는 지표 값으로 매우 유용할 것으로 생각되었다. 또 원형도는 펠렛형 균사체의 표면에서 균사 생육 정도를 판정하는데 유용한 것으로 나타났다.
- 그러나 본 연구에서는 ammonium phosphate의 첨가 농도가 3g/l 이상의 경우에는 배양이 진행됨에 따라 주로 펠렛형태로의 균사 생육이 관찰되었고, 균사체의 빈도수 또한증가되었다. 또 7 g/Z 이상의 ammonium phosphate를 첨가한 경우에는 pellet의 크기는 커지는 반면, 그 빈도수는 이보다 낮은 농도의 ammonium phosphate 첨가 시보다 낮은 것을 관찰할 수 있었다. 사상균의 펠렛형성 기작은 아직 정확하게 밝혀지지 않았으므로, 이와 같이 고농도 ammo nium phosphate 첨가구에서의 펠렛 형성 및 펠렛 크기의 증가에 대한 이유는 알 수 없다.
- 따라서' fractal 차원은 균사 형태의 변화를 측정하는 지표 값으로 매우 유용할 것으로 생각되었다. 또 원형도는 펠렛형 균사체의 표면에서 균사 생육 정도를 판정하는데 유용한 것으로 나타났다.
- 류(1994)도 균사의 fractal 차원과 펠렛의 compactness 및 roughness 간의 상관 관계를 이용하여 펠렛의 형태분석을 시도한 결과, fractal 차원이 형태 분석에 매우 유효함을 보고하였다. 또 이러한 fractal 차원의 변화는 배양 중 균사형태의 변화와도 매우 상관성이 높은 것으로 나타났다. 즉, Fig.
- 5는 배양 시에 관찰되는 필라멘트형 균사체, 펠렛형 균사체 및 이들 두 가지 형태가 모두 존재할 경우의 fractal 차원을 계산한 결과이다. 면적과 둘레 길이의 관계로부터 산출한 fractal 차원의 값은 필라멘트형 균사체와 펠렛형 균사체에서 각각 1.31 및 1.02로 계산되어, fractal 차원은 서로 다른 극단적인 균사형태에서 서로 다른 값을 나타냄을 보였다. 그러나 두 가지 형태가 모두 존재하였을 경우의 fractal 차원의 값은 1.
- 7은 ammonium phosphate 무첨가 구 및 첨가 구(0 및 llg/Z)에서의 원형도를 비교한 결과로, 이 때, 완전한 원의 경우의 원형도는 1의 값을 갖는다. 배양경시 변화를 보면 ammonium phosphate 무첨가구에서는 균사 생육이 왕성한 증식기(3~5일)에서는 원형도가 높은 쪽의 빈도수가 증가하고, 분포 또한 넓은 범위를 가지는 반면, 정지기에 이르면 원형도의 값이 각각 3.18 및 2에서 최대의 빈도수를 나타내었다. 그러나 ammonium phosphate 첨가 구의 경우는 구체 형태에 근접하는 것을 볼 수 있었다.
- 영상분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 배지 조성 및 배양 조건에 따른 균사체 형태의 배양경시변화를 영상 분석한 결과, non-branched long filamentous mycelium, non branched short mycelium, branched long filamentous my celium, branched short mycelium, entangled mycelium 및 각종 clump의 필라멘트 형태와, smooth pellet, rough pellet 및 hollow rough pellet의 폘렛 형태 등, 다양한 형태를 관찰할 수 있었다. Ammonium ion이 낮은 경우에는 필라멘트 형태의 균사 생육이 주인 반면, 높은 농도로 갈수록 펠렛 형태의 균사 생육이 주로 관찰되었다.
- Ammonium ion이 낮은 경우에는 필라멘트 형태의 균사 생육이 주인 반면, 높은 농도로 갈수록 펠렛 형태의 균사 생육이 주로 관찰되었다. 이러한 형태의 변화를 수치화 하는 수단으로 fractal 차원을 이용하여 형태를 분류한 결과, 11 gll의 ammonium phosphate 농도에서 주로 나타나는 균사형태의 fractal 차원은 1.05 이었으나(펠렛형), ammonium phosphate의 결핍 시에 주로 나타나는 균사 형태의 fractal 차원은 1.3이었다(필라멘트형). 또 필라멘트형 및 펠렛형 균사체가 공존할 때의 fractal 차원은 1.
- 이상의 실험으로부터 ammonium phosphate는 펠렛의 형성과 매우 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었고, fractal 차원은 필라멘트형 및 펠렛형 균사체의 형태 분류와 배양 중의 형태 변화에, 그리고 원형도는 펠렛 표면의 균사 생육 정도의 판정 지표로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각되 었다.
- 86)은 배양경과에 따라 증가하는 경향을 나타내어 fractal 차원의 변화와도 유사한 경향을 보였다. 특히, 원형도 값은 폘렛 표면의 균사 생장의 정도를 간접적으로 추측할 수 있을 것으로 판단되었다. 따라시, 이를 보다 면밀히 검토하기 위하여 ammonium pho-sphate# (Mlg/Z로 첨가하였을 때 펠렛 표면의 균사 생육의 형태를 현미경으로 확대 관찰하였으며, 그 결과를 Fig.
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