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문제 정의
- SL러므로 본 연구에서는 한국산 겨우살이 물 추출물과 이 로부터 분리한 렉틴 성분을 실험적으로 간암을 유도한 흰쥐 에 게 양을 다르게 투여 하여 간세 포 암의 초기 지표로서 태 반 형 glutathione-S transferase 양성 병 소의 면적 과 수를 면역 조직 화학적 으로 측정 하고, 간 기 능의 지 표로 쓰이는 GOT와 GPT 활성도 및 간 세포성 암종의 조기 진단에 쓰이는 a~ L-fucosidase의 활성도를 측정함으로써 겨우살이 물 추출 물과 렉 틴의 수준이 쥐 간의 암화과정 에 영향을 주는지 를 알아보고자 하였다.
- 혈청 GOT, GPT 및 a -L-fucosidase 활성도 변화 : 혈 청 GOT와 GPT의 활성도는 간 기능의 지표로 널리 사용되는 것으로 본 연구에서도 발암물질 투여와 겨우살이, 렉틴이 간 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청 GOT와 GPT 의 활성 도를 조사하였다. 혈청 GOT 활성도에 대해 王사한 결과 유의적이지는 않지만 발암물질 투여에 따라 증가하는 경향을 보였고, 겨우살이나 렉틴의 투여 에 따라서는 겨우살 이 종류나 량에 따른 효과가 나타나지 않았다.
제안 방법
- , Burlingame, CA)에 따라 GST-P+ foci를 검색하는 면역 염색법을 시행하였다. GST-P+ foci 수와 면적은 영상분석장치(VIDEOPLAN, Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- GST-P+ foci 염색 및 측정 : GST-P+ foci는 면역 조직화 학적 인 염 색을 실시하였고, 영상분석 장치로 측정하여 간 조직의 단위면적당 foci의 수와 면적으로 나타내었다. 즉, 파라 핀으로 고정시켜 미세 절편으로 만든 조직 슬라이드를 건조 시 킨 후 ABC 법 (15) (Vectastain ABC kit, Vector Labs.
- Jang 등(14)의 방범을 이용하여, 3주령 Sprague-Dawley 종을 사용하였다. 각 군은 10마리로 나누어 발암물질 투여는 실험 개 시 1주에 발암 개 시 물질로서 DEN을 체중 kg당 50 mg 을 생리식염수에 녹여 2회 복강 투여하였고, 1주일 후부터 발암물질 투여군에만 음용수에 0.05% phenobarbital(PB)을 섞어서 발암촉진물칠로 공급하였다. 겨우살이 물 추출물과 렉틴의 투여는 발암물질 투여 1주일 후부터 유럽산 겨우살이 물 추출물 10 Hg/kg BW(Body Weight)으로 투여 한 군, 한국 산 겨우살이 물 추출물 10 Rg/kg BW 투여군과 100 ug/kg BW 투여군, 렉틴 1 ng/kg BW 투여군과 10 ng/kg BW 투여군으로 나누어 각각 농도에 맞게 겨우살이 물 추출물콰 렉틴 phosphate buffered saline(PBS)^] 희석 하여 매주 2회 동일한 요일에 뽁강후여를 하였으며, 대조군은 주사에 의한 효과를 배제하기 위하여 동일한 양의 PBS를 투여하였다.
- 05% phenobarbital(PB)을 섞어서 발암촉진물칠로 공급하였다. 겨우살이 물 추출물과 렉틴의 투여는 발암물질 투여 1주일 후부터 유럽산 겨우살이 물 추출물 10 Hg/kg BW(Body Weight)으로 투여 한 군, 한국 산 겨우살이 물 추출물 10 Rg/kg BW 투여군과 100 ug/kg BW 투여군, 렉틴 1 ng/kg BW 투여군과 10 ng/kg BW 투여군으로 나누어 각각 농도에 맞게 겨우살이 물 추출물콰 렉틴 phosphate buffered saline(PBS)^] 희석 하여 매주 2회 동일한 요일에 뽁강후여를 하였으며, 대조군은 주사에 의한 효과를 배제하기 위하여 동일한 양의 PBS를 투여하였다. 총 사육 기간은 9주로 하였다(Fig.
- 렉틴의 분리는 아시알로페투인-세파로스(asialofetuin- Sepharose) 4B 컬럼을 이용하였는데, 겨우살이의 새순 세 마 디의 잎, 열매 및 줄기를 분류하여 세절한 후 증류수로 세척 한 다음 동길 건조시 켰다. 상기 동결 건조된 겨우살이 1kg을 0.
- 80—90 g정도로 이 유된 3주령 Sprague-Dawley종을 이용하여 각 군간의 차이가 없도록 randomized block design에 따라 유럽산 겨우살이 물 추출물 투여, 한국산 겨우살이 물 추출물과 렉 틴의 투여 량, diethylnitrosamine(DEN) 투여 여 부에 따라 12군£로 나누어 실험식이를 공급하였고, 식이는 A1N-76 조성을 기본으로 전암성 병변의 생성을 촉진하기 위하여 corn oil。] 10% 함유되도록 변형하여 제조한 분말 사료를 공급하였다(Table 1). 발암물질의 투여 에 따라 식이 섭 취 량의 감소가 생기게 되므로 각 군별로 섭취 열량의 차이가 생기는 것을 방지흥卜기 위해서 발암물질 투여군의 섭취량 에 맞추어 제한 식이를 실시하였고, 물의 섭취는 제한하지 않았다.
- 실험동물은 9주 사육하여 단두법 으로 희생 하여 경동맥 에서 혈액을 취해 3, 000rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 얻었고, 희생 후 즉시 간을 절제하여 중량측정 후 좌우 간엽에서 조직을 5 mm 두께로 절제하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 이상 고정하여 조직염색에 사용하였으며, 혈청은 액체 질소에 급속 동결 시켜 -80℃에 보관하였다가 분 석시 꺼내 사용하였다.
- 7)으로 세척하였다. 컬럼에 흡착된 단백질을 0.2 M의 아세트산으로 용출시 킨 물질을 UV( /I max=280 nm)로 확인하여 피 크(peak)를 나타내는 분획을 모아 초여 과막으로 농 축하여 정제된 렉틴을 획득하였다.
- 혈청 GOT, GPT 및 a-L fucosidase 활성도 측정 : 간 기 능의 지 표로 사용되는 GOT, GPT의 활성 도는 kit(영 동제 약)를 사용하여 혈청에서 측정하였다.
대상 데이터
- Jang 등(14)의 방범을 이용하여, 3주령 Sprague-Dawley 종을 사용하였다. 각 군은 10마리로 나누어 발암물질 투여는 실험 개 시 1주에 발암 개 시 물질로서 DEN을 체중 kg당 50 mg 을 생리식염수에 녹여 2회 복강 투여하였고, 1주일 후부터 발암물질 투여군에만 음용수에 0.
데이터처리
- Values are mean. Different alphabets above the bar indicate significant difference by Duncan's multiple range test at p<0.05.
- J)Means with different superscripts within a column are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- eStatistical significance was calculated by 2-way ANOVA at a 느 0.03 NS = not significant, D 프 DEN injection, M 느 mi st] etoe or lectin injection, M x D = mistletoe x DEN.
- 겨우살이 물 추출물이나 렉틴의 투여, 발암물질 투여에 따른 효과를 보기 위하여 실험 결과를 2-way analysis of var~ iance(ANOVA)로 분석하여 a =0.05 수준에서 Duncan's mul- tiple range test에 의해 유의성을 검증하였다. 모든 실험 결과의 통계 처리는 Statistical Analysis System(SAS) program을 이용하였다.
- 05 수준에서 Duncan's mul- tiple range test에 의해 유의성을 검증하였다. 모든 실험 결과의 통계 처리는 Statistical Analysis System(SAS) program을 이용하였다.
이론/모형
- GST-P+ foci 염색 및 측정 : GST-P+ foci는 면역 조직화 학적 인 염 색을 실시하였고, 영상분석 장치로 측정하여 간 조직의 단위면적당 foci의 수와 면적으로 나타내었다. 즉, 파라 핀으로 고정시켜 미세 절편으로 만든 조직 슬라이드를 건조 시 킨 후 ABC 법 (15) (Vectastain ABC kit, Vector Labs., Burlingame, CA)에 따라 GST-P+ foci를 검색하는 면역 염색법을 시행하였다. GST-P+ foci 수와 면적은 영상분석장치(VIDEOPLAN, Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 혈 청 의 a -L-fucosidase의 활성 도는 p-nitrophenyl- a - L-fucopyranoside를 기질로 사용하여 fucosidase가 생성한 p-mtrophen이의 홉광도를 측정 하는 Zeilke 등의 방법 (16)으 로 측정하였다.
성능/효과
- 혈청의 a-L-fucosidase의 활성도는 간 세포성 암종 상태에서 증가되어 간의 셍검 없이도 혈청에서 간단하게 측정하여 조기 에 간암을 진단할 수 있는 지표로 알려져 있다(19). Fig. 4의 결과에 따르면 발암물질 투여 에 따라 a-L-fucosidase의 활성도가 유의적으로 증가하였고, 겨 우살이 종류나 겨우살 이와 렉 틴의 투여 량에 따는 효과는 나타나지 않았으나 발암 물질 투여군 중 렉틴을 투여한 군에서 a-L-fucosidase의 활 성도가 발암물질 만 투여한 군보다 낮은 것으로 나타났으나 유외적인 차이는 없었다.
- Table 2에 제시된 것처럼 9주간의 동물사육 후 체중은 발 암불질에 의해 식이 섭취가 감소하는 것을 고려하여 제한 섭 취를 실시하였으나 발암물질 투여나 겨우살이 또는 렉틴의 투여 에 따라 약간 감소하는 경향을 보였고, 간 무게는 겨우살 이, 렉 던의 효과는 보이지 않으나 발암물질 투여 에 따라 유의적으로 증가하였다. 간은 신체중에서 독성을 해독하는 중요한 기 관으로 독성 물질 이 체 내에 투여 되면 그 크기가 증가한다.
- 또한 유럽산과 한국산의 겨 우살이 추출물을 동량(10 Ug/kg BW)투여하여 발암억제 효과를 비교하였을 때 유럽산 겨우살이 추출물을 투여한 군에서 한국산 겨우살이 추출믈을 투여한 군보다 GST-P* foci의 수나 면적이 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. 겨우살이 중에서 항암효과를 나타내는 물질로 밝혀진 렉틴에 대한 효과를 알아보기 위해 투여 수준을 달리한 렉틴 투여군에서도 10 ng/kg BW 수준으로 투여 한 군이 1 ng/kg BW 수준으로 투여 한 군보다 GST-P, foe】의 수나 면적이 유의적으로 감소하는 결과를 나 타냈다(Fig. 2). 렉 틴의 투여 수준은 본 연구에 사용한 한국산 겨우살이 물 추출물에 함유된 렉 틴의 함량과 동일한 양이 되 도록 한 것으로 겨우살이 물 추출물에 대한 foci 생성 억제효 과보다는 낮게 나타났다.
- 간암을 유도시킨 횐쥐에 대한 선행연구들에서도 발암물 질을 투여한 군의 간은 크기와 무게가 증가하고, 육안으로 보아도 단단하게 굳어 경화가 되어있는 것을 볼 수 있었다. 그러므로 발암물질 투여 에 대한 간 무게의 증가에 대한 이 번 연구의 결과는 선행연구(17)들과 일치하는 것이며, 겨우살이에 대한 효과는 나타나지 않은 것으로 보아 본 실험에 사용한 양의 겨우살이나 렉틴은 간의 크기와 무게에 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다. 체중에 대한 상대적 인 간 무게에 대한 결과도 간 무게의 결과와 유사하였고, 유럽산보다는 한국산 겨우살이 물 추출물의 간 무게와 체중에 대한 간 무게의 비율이 작게 나타나 한국산 겨 우살이 물 추출물의 독성 이 간에 영향을 작게 미치는 것으로 보여진다.
- 이때 농도의 표시 100 mg/ mL는 신선한 겨우살이 100 mg으로 추출한 용액 1 mL를 뜻한다. 그리고, 효소결합 렉틴 검출법 (ELLA)을 이용하여 겨우살이 수 추출물 중의 렉틴을 정량한 결과, 1 mg/mL 농도의 VCE 1 mL에는 30 ng의 VCA가 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
- 2). 또한 유럽산과 한국산의 겨 우살이 추출물을 동량(10 Ug/kg BW)투여하여 발암억제 효과를 비교하였을 때 유럽산 겨우살이 추출물을 투여한 군에서 한국산 겨우살이 추출믈을 투여한 군보다 GST-P* foci의 수나 면적이 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. 겨우살이 중에서 항암효과를 나타내는 물질로 밝혀진 렉틴에 대한 효과를 알아보기 위해 투여 수준을 달리한 렉틴 투여군에서도 10 ng/kg BW 수준으로 투여 한 군이 1 ng/kg BW 수준으로 투여 한 군보다 GST-P, foe】의 수나 면적이 유의적으로 감소하는 결과를 나 타냈다(Fig.
- 이는 본 연구에서 사용한 투여 량이 체내에 독성을 미치지 않을 정도의 낮은 수준이 었기 때문으로 사료된다. 또한 한국산 겨우살 이 물 추출물이나 렉틴은 간 발암억제 효과가 있는 것으로 보이 며 투여 량을 증가시 켰을 때 효과가 큰 것으로 나타났다. 그러나 유럼산과 한국산 겨우살이 의 발암억 제 효과는 큰 차이가 없는 것으로 보인다.
- 그러나 유럼산과 한국산 겨우살이 의 발암억 제 효과는 큰 차이가 없는 것으로 보인다. 또한 한국산 겨우살이 에서 추줄한 렉틴에 대한 발암억제 효과가 겨우살이물 추출물보다 약간 낮게 나타나 렉틴 이외의 겨우살이의 여러 성분들이 렉틴과 상호적.으로 작용할 때 항암효과가 더 커지는 것으로 사료된다.
- 2). 렉 틴의 투여 수준은 본 연구에 사용한 한국산 겨우살이 물 추출물에 함유된 렉 틴의 함량과 동일한 양이 되 도록 한 것으로 겨우살이 물 추출물에 대한 foci 생성 억제효 과보다는 낮게 나타났다. 이러한 결과는 비록 겨우살이 추출 물 중에서 주요 항암작용을 하는 물질이 렉틴이라 하더라도 겨우살이 중 렉틴 이외의 다른 물질들이 렉틴과 서로 상호적 으로 작용하여야 항암효과를 더 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.
- 본 연구에서 GST-P* foci 생성정도를 측정한 결과 겨우살 이 물 추출물 투여 했을 때 GST-F foci의 수나 면적 이 감소 하였고 투여 량이 증가시 그 효과가 더욱 컸다(Fig. 2). 또한 유럽산과 한국산의 겨 우살이 추출물을 동량(10 Ug/kg BW)투여하여 발암억제 효과를 비교하였을 때 유럽산 겨우살이 추출물을 투여한 군에서 한국산 겨우살이 추출믈을 투여한 군보다 GST-P* foci의 수나 면적이 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없었다.
- 3). 이 결과는 본 실험에 사용한 양의 겨우살이 물 추출물이나 렉턴이 간 기능에 영향을 미치지 않음을 보여주는 것으로서 겨우살이 추출믈과 렉 틴의 생체 내 독성 이 나타나지 않음을 시 사한다.
- 렉 틴의 투여 수준은 본 연구에 사용한 한국산 겨우살이 물 추출물에 함유된 렉 틴의 함량과 동일한 양이 되 도록 한 것으로 겨우살이 물 추출물에 대한 foci 생성 억제효 과보다는 낮게 나타났다. 이러한 결과는 비록 겨우살이 추출 물 중에서 주요 항암작용을 하는 물질이 렉틴이라 하더라도 겨우살이 중 렉틴 이외의 다른 물질들이 렉틴과 서로 상호적 으로 작용하여야 항암효과를 더 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.
- 이상의 결과로부터 겨우살이 물 추출물과 렉 틴은 종류와 투여 량에 따라 혈청 GOT, GPT 활성도나 a -L-fucosidase 활성도가 영향을 받지 않는 것을 볼 수가 있었다. 이는 본 연구에서 사용한 투여 량이 체내에 독성을 미치지 않을 정도의 낮은 수준이 었기 때문으로 사료된다.
- 혈청 GOT, GPT 및 a -L-fucosidase 활성도 변화 : 혈 청 GOT와 GPT의 활성도는 간 기능의 지표로 널리 사용되는 것으로 본 연구에서도 발암물질 투여와 겨우살이, 렉틴이 간 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청 GOT와 GPT 의 활성 도를 조사하였다. 혈청 GOT 활성도에 대해 王사한 결과 유의적이지는 않지만 발암물질 투여에 따라 증가하는 경향을 보였고, 겨우살이나 렉틴의 투여 에 따라서는 겨우살 이 종류나 량에 따른 효과가 나타나지 않았다. GPT의 활성 도 에 대해서는 발암물질의 투여에 따라 증가하였으며, 겨우살 이와 렉틴에 따라서는 GOT와 비슷한 경향을 나타냈다(Fig.
후속연구
- 으로 작용할 때 항암효과가 더 커지는 것으로 사료된다. 따라서 앞으로 겨우살이와 렉턴의 in vivo 항암효과를 규명하기 위하여 더 높은 수준의 투여 량에 따른 독성 연구와 관련기전에 대한 연구가 더 수행되어야 할 것이다.
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